| 研究課題/領域番号 |
20K08271
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| 研究機関 | 愛知県医療療育総合センター発達障害研究所 |
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研究代表者 |
野田 万理子 愛知県医療療育総合センター発達障害研究所, 分子病態研究部, 研究員 (50571311)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 抑制性神経細胞 / 興奮性神経細胞 / E/Iバランス / 神経細胞移動 / ASD / てんかん / 知的障害 |
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| 研究実績の概要 |
自閉スペクトラム障害(ASD)を含む発達障害にはてんかんを伴うものが多い。「てんかん」の病態の本質は大脳皮質神経細胞の過剰興奮であり、興奮性（Excitatory）と抑制性（Inhibitory）のバランス（E/Iバランス）の崩壊である。従って「てんかん」の病態形成には、興奮性神経細胞の機能異常（過剰興奮）だけではなく、抑制性神経細胞の機能異常（脱落や機能低下）の寄与も非常に大きい。発達障害原因候補遺伝子の中には、興奮性神経細胞において何ら異常表現型が認められない分子も存在する。本研究ではその中で特に発達障害の病態と関連が深い３種類の分子に着目した。すなわち、難治性乳幼児てんかんの責任遺伝子であるPHACTR1、ASD患者で新規ミスセンス変異が複数例報告されている転写調節因子POGZ、知的障害（ID）患者で複数個所の新規ミスセンス変異が見いだされたMED13Lを解析のターゲットとした。これまでのてんかん研究の主体は興奮性神経細胞におかれることが多かった。本研究では、これまで着目されてこなかった抑制性神経細胞に焦点を当てて解析を行うことで、発達障害責任遺伝子の新たな機能を明らかにすることができると考える。
昨年度までに、胎仔期の抑制性神経細胞の高効率なラベル化法を確立した。また免疫組織学的方法により、離乳直後のマウス脳組織切片で、成熟神経細胞のマーカーであるParvalbumin (PV), Somatostatin (SST)の発現を確認している。解析予定のPHACTR1, POGZ, MED13Lに関する発現抑制ベクターやレスキューベクターなどはすでに構築済みである。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
抑制性神経細胞への子宮内胎仔脳遺伝子導入は、導入時期を胎生(E)12とすることで高効率かつ選択的な導入が可能となったが、抑制性神経細胞の主要な産生部位である基底核原基（ganglionic eminence (GE)）の３部位（caudal GE (CGE), medial GE (MGE), lateral GE (LGE))全てにラベルされたため、特に皮質に向かう抑制性神経細胞（MGE由来）の移動解析が困難となった。MGE選択的な抑制性神経細胞へのラベルを行うため、遺伝子改変マウスを用いた方法に切り替える予定でいたが、新型コロナウィルスの流行により、海外との契約状況に多大なる遅延が生じ、希望する遺伝子改変マウスの入手目処が立っていない。
そのため、現在は脳組織スライスを用いたlive imagingにより、皮質に向かう抑制性神経細胞を可視化し、PHACTR1, POGZ, MED13Lのノックダウンの影響を検討する手法に切り替える予定である。
これら以外に、オートファジーに必須の分子であるWDR45が、知的障害を伴う神経変性疾患beta-propeller protein-associated neurodegeneration(BPAN)の病態を形成するメカニズムの解明を行い、原著論文として発表した。
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| 今後の研究の推進方策 |
In vitroでの抑制性神経細胞解析系の構築を早急に行う。今年度新たに研究室に導入した共焦点レーザー顕微鏡システム（ニコン、A1R HD25）を用いることで、これまでよりも高解像度かつ高速なlive imagingが可能となる。このシステムを用いて、胎生期大脳皮質の抑制性神経細胞ライブイメージングを行うことにより、皮質へと移動途中の抑制性神経細胞の形態・速度変化の数値化を行い、疾患を模倣した状態と健常状態との比較解析を行うことが可能となる。In vivoの解析は、遺伝子改変マウスの入手ができなかった場合、野生型マウスを用いて行い、生後、皮質に存在する抑制性神経細胞の免疫染色法による識別などで比較検討を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
新型コロナウィルスの流行により、学会などでの発表形式が全てオンラインとなり、旅費としての使用額がゼロとなった。
この残額分は、今年度購入した共焦点レーザー顕微鏡システム一式（A1R HD25）リース費用に充てる計画である。
これ以外には、ベクター構築に必要な試薬や、初代培養神経細胞関係の試薬・器具、妊娠マウス購入費用、抗体購入などに使用する予定である。
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