1分子シークエンサーを用いたウイルスゲノム解析によるウイルス制御後肝病態の解明

2021 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 20K08281
• 研究機関: 山梨大学
• 研究代表者: 前川 伸哉 山梨大学, 大学院総合研究部, 講師 (70397298)
• 研究期間 (年度): 2020-04-01 – 2023-03-31
• キーワード: ウイルスゲノム / 1分子シークエンシング / HCV / HBV / ウイルス制御後の病態進展

研究実績の概要

●抗ウイルス治療による肝炎ウイルス制御が可能となった今日において、肝癌症例は未だ十分な減少を認めておらず、またウイルス制御後に肝硬変が進展する 症例が存在するが、肝炎ウイルス制御下においても、治療前のウイルスゲノム構造がこのような病態を修飾する可能性が疑われてきた。特に肝病態に対するウイ ルスゲノム変異の関連解析において、個々のHCV分子におけるコアとNS5A変異の直列変異情報の取得が強く望まれていた。しかしながら、宿主中でウイルスはゲ ノムの混在状態(=quasispecies)で存在するが、従来のショートリードシークエンスでは個々のHCV分子の解析は困難であった。
● 近年登場したロングリード可能な一分子シークエンサーNanoporeはリードエラーが高い問題があったが、rolling circle amplification (RCA)法によって、 1分子をタンデムに幾度も増幅・解析することにより、エラー率を劇的に低下させ、真の変異を検出することが可能となった。
● 本年度は、昨年度までに我々が構築したHCV一分子シークエンスシステム、すなわちRCA法を用いることにより100分子 以上のHCVゲノム配列を1分子ごとに高精度に決定する系において得られる膨大なシークエンスデータを迅速に分類する”ハプロタイピングシステム”を構築した。本システムを用いることにより、抗ウイルス薬耐性時に出現する変異ウイルスの起源と消長などの進化過程を明瞭に可視化することが可能となった。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

●本年度導入したハプロタイピングシステムを用いることにより、昨年度に構築したHCV一分子シークエンスシステムから得られる膨大なHCVゲノム混在状態のデータを迅速に”型分け”することが可能となった。
●遺伝子型1型のみならず、遺伝子型2型のNanoporeシークエンスシステムをも構築しえた。

今後の研究の推進方策

●HCVの様々な病態における本方法の応用を進め、感染状態・ウイルス排除後の病態形成におけるウイルスゲノムの関与についてさらに明らかとする。
●ウイルスゲノム変異に対応した宿主因子について、インターフェロン誘導遺伝子群を含むサイトカイン等、炎症関連分子に注目し、血液を用いて関連を検討する。
●HBVにおいても、RCA法・nanoporeシークエンシングを導入し、HBV全ゲノムの一分子シークエンスシステムの確立を目指してゆく。precision medicineとしてのウイルスゲノムの意義について検討を行う。

次年度使用額が生じた理由

408円は令和4年度に繰越します。

研究成果

• [雑誌論文] Analysis of direct-acting antiviral-resistant hepatitis C virus haplotype diversity by single-molecule and long-read sequencing (2022)
  • 著者名/発表者名: Yamauchi K, Sato M, Osawa L, Matsuda S, Komiyama Y, Nakakuki N, Takada H, Katoh R, Muraoka M, Suzuki Y, Tatsumi A, Miura M, Takano S, Amemiya F, Fukasawa M, Nakayama Y, Yamaguchi T, Inoue T, Maekawa S, Enomoto N.
  • 雑誌名: Hepatol Commun 巻: in press ページ: in press
  • DOI: 10.1002/hep4.1929. Online ahead of print.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Inhibitory effect of a novel thiazolidinedione derivative on hepatitis B virus entry. (2021)
  • 著者名/発表者名: Tanaka T, Okuyama-Dobashi K, Motohashi R, Yokoe H, Takahashi K, Wiriyasermkul P, Kasai H, Yamashita A, Maekawa S, Enomoto N, Ryo A, Nagamori S, Tsubuki M, Moriishi K.
  • 雑誌名: Antiviral Res 巻: 194 ページ: 105165
  • DOI: 10.1016/j.antiviral.2021.105165. Epub 2021 Aug 19.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Usefulness of Circulating CYFRA21-1 in Patients as a Biomarker in Patients Taking Sorafenib or Lenvatinib for Unresectable Hepatocellular Carcinoma. (2021)
  • 著者名/発表者名: Takada H, Osawa L, Komiyama Y, Kato R, Nakakuki N, Muraoka M, Suzuki Y, Tatsumi A, Sato M, Takahashi E. Maekawa S, Enomoto N.
  • 雑誌名: Reports 巻: in press ページ: in press
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Usefulness of Cell-Free Human Telomerase Reverse Transcriptase Mutant DNA Quantification in Blood for Predicting Hepatocellular Carcinoma Treatment Efficacy (2021)
  • 著者名/発表者名: Muraoka M, Maekawa S, Katoh R, Komiyama Y, Nakakuki N, Takada H, Matsuda S, Suzuki Y, Sato M, Tatsumi A, Miura M, Amemiya F, Shindo H, Takano S, Fukasawa M, Yamauchi K, Yamaguchi T, Nakayama Y, Inoue T, Enomoto N.
  • 雑誌名: Hepatol Commun 巻: 5 ページ: 1927-1938
  • DOI: 10.1002/hep4.1762. Epub 2021 Jul 28.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] The impact of antiviral therapy for hepatitis C virus on the survival of patients after hepatocellular carcinoma treatment. (2021)
  • 著者名/発表者名: Mori Y, Matsuda S, Sato M, Muraoka M, Suzuki Y, Tatsumi A, Nakayama Y, Inoue T, Maekawa S, Enomoto N.
  • 雑誌名: Internal Medicine 巻: Online ahead of print. ページ: in press
  • 査読あり / オープンアクセス