| 研究課題/領域番号 |
20K08286
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
小沼 邦重 京都大学, 医学研究科, 研究員 (90597890)
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| 研究分担者 |
井上 正宏 京都大学, 医学研究科, 特定教授 (10342990)
近藤 純平 京都大学, 医学研究科, 特定助教 (80624593)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | がん細胞集団の転移 |
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| 研究実績の概要 |
集団としてのがん細胞が転移に寄与することが報告されているが、その機構は未だ不明な点が多い。がん細胞集団である大腸がんCTOSは、細胞外マトリクスの存在下では、スフェロイド内にapical 面で覆われた管腔を持つ状態（apical-in）になるが、浮遊培養下では、apical面がスフェロイドの外周を覆う状態（apical-out）を示し、培養条件を変えると短期間で相互転換する（極性転換）。がん細胞は集団として血管内へ侵入した場合に極性状態を転換させると予想されるが、実際に患者大腸がんでもそのような病変像が観察される。本研究では、apical-outの極性状態が転移過程に及ぼす影響を検討した。正常腸管上皮はapical面から活性酸素を放出し、感染防御に寄与していることが知られている。CTOS (C45)の培養液中では、apical-outの活性酸素量がapical-inと比較して有意に高かった。次に、肝転移における重要な段階である、がん細胞の肝血管内皮細胞への接着能を比較した。蛍光標識したヒト肝血管内皮細胞を単層培養し、蛍光標識したC45を重層した。播種3時間後に非接着細胞を除去し、蛍光を定量することで接着率を算出した結果、apical-inと比較してapical-outのC45は接着率が有意に増加した。また、接着後に、がん細胞が血管内皮を置換して広がる現象（クリアランス）を定量したところ、 apical-inと比較してapical-outのC45はクリアランス率が増加した。抗酸化物質のNACで処理した場合、さらにshRNAにより活性酸素種産生酵素の一つであるNOX1の発現量を減少させた場合、これらの現象は抑制された。以上の結果からapical-outの極性状態では、apical面の外側に放出された活性酸素が血管内皮に作用し、血管内から血管外への浸潤を促進することが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
細胞集団の転移過程を再現したin vitro アッセイモデルの確立を行うにあたり、当初予定していた1-1）血管内皮細胞との接着能、1-2）血管内皮細胞排除能、1-3）細胞外マトリクスと接した際のoutgrowth能、を定量評価できるin vitroアッセイモデルが順調に確立出来た。また、apical面からCTOSの外側に放出される活性酸素が血管内皮に作用することを示し、ここまでは仮説通りの展開であった。
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| 今後の研究の推進方策 |
細胞外マトリックス存在下から非存在下に培養条件を変えると、CTOSはapical-outへ極性転換する。このような極性転換を阻害・促進する薬剤をスクリーニングする。我々は既に、極性転換を簡便に評価するために、apical面を蛍光標識した実験系を確立している。具体的には、Thy-1 のGPI結合シグナルシークエンスでC末端を修飾したGFP発現ベクター（Rhee 2006 Genesis）からPiggyBacベクターを作製し、大腸癌CTOSに導入した。このモデルに、約400種類の化合物を添加し、apical-inからapical-outへの極性転換を阻害する化合物を同定する。ヒット化合物を基にして、極性転換を制御する分子あるいは経路を明らかにする。特定の分子に対してshRNAを用いた発現抑制実験あるいは発現ベクターを用いた強制発現実験を行う。候補化合物あるいは分子を標的に、移植モデルを用いた生体における実効性を検証する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
ほぼ予定通り計画が遂行できたため。次年度の「apical-in からapical-out への極性転換を阻害する化合物のスクリーニングと極性を制御する分子の同定」に予算を使用する予定である。
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