| 研究課題/領域番号 |
20K08296
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| 研究機関 | 順天堂大学 |
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研究代表者 |
渡辺 純夫 順天堂大学, 医学部, 特任教授 (20138225)
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| 研究分担者 |
山科 俊平 順天堂大学, 医学部, 准教授 (30338412)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | オートファジー / 核マトリクス蛋白 / アミノ酸代謝 |
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| 研究実績の概要 |
①癌細胞におけるアミノ酸代謝変化とオートファジーの動向との関連性の解明：アミノ酸代謝リプログラミングとオートファジー関連核蛋白の関与を明らかにするという目的で以下の検討を行った。まずオートファジー機能が亢進している肝癌細胞株と逆に低下している細胞株を選別するために低栄養環境下で複数の肝腫瘍細胞株を培養し、オートファゴソーム膜蛋白分子であるLC3発現の変化をウエスタンブロット法で評価した。オートファジー誘導が抑制されている細胞株と亢進している細胞株を選別したが、オートファジー蛋白分解能はリソソーム機能の変化の影響も受けるためオートファゴソーム発現変化だけではオートファジーの蛋白分解能の評価が不十分であることが判明した。そこでリソソーム蛋白分解酵素の発現とオートファジー分解基質であるp62発現変化も併せて行う必要が生じた。我々が解析を行った細胞株のうちでオートファジーを介した蛋白分解が一番活発な細胞株と一番蛋白分解能が低い細胞株において、メタボローム解析を行い、オートファジー機能とアミノ酸代謝変化との関連性を解析しているところである。
②オートファジー機能の亢進した癌細胞と低下している癌細胞において発現が変化する核蛋白の同定とアミノ酸代謝変化の関連性の解明を行うために、まずは①で検討したようにオートファジー機能亢進細胞株とオートファジー機能低下細胞株を同定する必要があった。これらの細胞株から核蛋白を抽出し、可溶性分画と非可溶性分画に分離した。通常の電気泳動解析で発現蛋白には明らかに差があることが分かったため、蛋白の２次元電気泳動ならびにLC-MS解析に移行する予定である。同定蛋白に関してはデータマイニング解析を行い、アミノ酸代謝と関連性の高い蛋白を選別する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
アミノ酸代謝リプログラミングとオートファジー関連核蛋白の関与を明らかにするために複数の肝癌細胞株のうちオートファジー機能が促進している細胞株とオートファジー機能が低下している細胞株を選別する必要があった。しかし細胞株によってリソソーム蛋白分解酵素発現の違いなどが影響し、オートファゴソームが最初から蓄積している細胞株が存在したため、単純なオートファジー膜蛋白発現解析だけでは不十分と思われた。この細胞同定のところは今後の研究において非常に重要なポイントであったために時間をかける必要があった。
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| 今後の研究の推進方策 |
オートファジー誘導亢進細胞と非亢進細胞株の同定に時間を要してしまったが、重要なポイントと思われる細胞選別は終了したため、以下の通り次のステップの研究に移行している。細胞のメタボローム変化に相関して発現変化する核蛋白を同定するために抽出した蛋白の２次元電気泳動ならびにLC-MS解析を行う予定である。同定蛋白に関してはデータマイニング解析を行い、アミノ酸代謝と関連性の高い蛋白を選別する。またこれら細胞株の核蛋白抽出も行っており発現変化に関しても検討を行っていく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
オートファジー誘導亢進細胞と非亢進細胞株の同定に時間を要してしまったために、核蛋白発現解析とメタボローム解析が少し遅れてしまっている。これらの実験部分の経費を次年度に持ち込む必要があった。
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