| 研究課題/領域番号 |
20K08343
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| 研究機関 | 日本大学 |
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研究代表者 |
増崎 亮太 日本大学, 医学部, 助教 (20866149)
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| 研究分担者 |
神田 達郎 日本大学, 医学部, 准教授 (20345002)
森山 光彦 日本大学, 医学部, 教授 (50191060)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 肝線維化 / 細胞外マトリックス / インテグリン |
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| 研究実績の概要 |
インテグリンは、細胞表面の原形質膜にある細胞接着分子であり、細胞外ドメインは細胞外マトリックス（ECM）の受容体としての細胞－ECMの細胞接着の主役であり、細胞－細胞間の接着にも関与する。細胞内ドメインは細胞骨格制御タンパク質や非レセプター型チロシンキナーゼを含むシグナル伝達分子と結合する。インテグリンは、細胞接着、遊走、増殖、分化、ECMの再構築に関わるだけでなく、各種サイトカインのシグナルを調節するなど多様な機能を持つことがわかっている。肝臓に発現するインテグリンはすべてβ１鎖をもっており、これを肝臓特異的に欠失させ、正常肝組織に起こる変化とその機序を検討する。
これまで、我々はインテグリンβ１を肝特異的に欠失させることで、肝細胞の配列の乱れ、胆管細胞の増生、肝臓の線維化を来たすことを報告したが、これは欠失に伴う肝細胞死（アノイキス）がその一因を担っている可能性が示唆された。アノイキスとは、細胞とECM接着の喪失で誘導されるアポトーシスである。そのため、肝線維化モデルを作成し、ECMが過剰にある状態で、欠失が肝線維化にどのような変化を来たすかを検討する。
本年度は、インテグリンβ１肝特異的欠失マウスにおいて、肝線維化とTGFβの活性化機序を調べるために、細胞培養実験を追加で行った。インテグリン欠失初代肝細胞培養液を用いてJS1細胞を培養したところ、コントロールと比し、collagen １α１とSMAのmRNA発現上昇を向線維化シグナルの亢進を認めた。これまでの結果をまとめ、投稿し、英文誌に受理された（Am J Pathol 2021, 191:309-319）。
今後は、肝特異的インテグリン欠失マウスを用いて、チオアセタミドを用いたマウス肝線維化モデルを作成し、欠失型と野生型で線維化の程度を比較する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
マウス星細胞株であるJS1 cellの培養を行い、インテグリンβ１肝特異的欠失マウスの初代肝細胞培養上清を加えることで向線維化シグナルの活性化を認めた。上清中のTGFβのタンパク質濃度は野生型に比し、欠失型で有意に上昇しており、これまでのデータと合わせインテグリンβ１の欠失が、TGFβの活性化と星細胞の活性化を来たすことが確認できた。
マウス線維化モデルの作成については、Jackson Laboratoryから購入予定であったマウスが胚凍結となってしまったため、研究代表者の前任地であるVanderbilt University Medical Centerからマウスを移送することとなり、動物実験の導入に遅れを認めた。
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| 今後の研究の推進方策 |
インテグリンβ1floxedマウスに、AAV-MUP-iCreあるいはAAV-MUP-eGFPを投与し、欠失あるいは野生型マウスを作成する。チオアセタミドを投与し、コントロール群で肝線維化モデル作成をHE染色とSirius Red染色で確認する。欠失群で線維化の程度を検討する。また関連する向線維化シグナルのmRNA 発現をqPCRで、タンパク発現をウエスタンブロットで検討する。これまでの実験では、欠失マウスで星細胞の活性化、TGF-βの発現亢進、MMP-13の発現低下、TIMP-1の発現亢進を認めた。検体採取後は迅速に関連シグナルの検討ができるものと思われる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
初年度にJackson laboratoryから購入予定であったマウスについて、購入直前に胚凍結となり高額となったため、研究代表者の前任地であるVanderbilt University Medical Centerから移送することとなった。MTA締結等の各種手続き、輸送会社の手配等に時間を要した。現在、各種手続きが完了し、搬入を待っている状況である。そのため、初年度にマウス購入は行わず、輸送に関する諸経費及び必要物品等の購入を次年度に行う予定とした。
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