| 研究課題/領域番号 |
20K08351
|
|---|
| 研究機関 | 千葉大学 |
|---|
研究代表者 |
池原 早苗 千葉大学, 大学院医学研究院, 助教 (50598779)
|
|---|
| 研究分担者 |
山口 高志 千葉大学, 大学院医学研究院, 講師 (60626563)
東 和彦 千葉大学, 大学院医学研究院, 技術専門職員 (80422260)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
|
| キーワード | 膵炎 / BKウイルス / 不顕性感染 / 遺伝子改変マウスモデル |
|---|
| 研究実績の概要 |
本研究では、① DOX誘導BK-LT膵炎マウスの病理学的解析、②DOX誘導BK-LT膵炎マウスの免疫学的解析、③ヒト膵組織と細胞を対象にしたBK-LT抗原の検出と炎症応答の検討を計画している。最初に、これまでの検討で得ていた結果の再現性を確実なものとすることを目的に、DOX投与依存的にBK-LT抗原を膵臓特異的に発現するトランスジェニックマウスの解析匹数を増やしたうえで、①を実施した。
①では、DOX投与開始前(0日目), 投与開始後7、14、28日目となるマウスを準備し、各群７匹より膵組織を採材して、病理組織学的解析を行った。これにより、DOX投与開始から顕在化してくる膵炎の特徴的な病理として、腺房細胞の消失と脂肪組織への置換、マッソントリクローム染色による線維化を確認した。また、採取組織を対象にしたRNA-seq解析や膵組織の破壊で増加するHydroxyproline量の定量などを行うことで、これまでの検討で得られていた遺伝子生化学的解析結果の再現性についても確認できた。以上より、BK-LTタンパク質発現マウスモデルにおいて、BK-LTタンパク質発現と膵炎発症の関連性を確認できたと結論した。
③では、作製していたBK-LTを特異的に検出できるモノクローナル抗体の調製と評価を完了した。抗体は、免疫に使用したペプチドを固相化したカラムを作製してアフィニテイ精製を行い、Biacore2000を用いた評価を実施した。作成した抗体は、BK-LT抗原と高い結合性を有することが確認できた。さらにDOX誘導BK-LT膵炎マウス組織のホルマリン固定パラフィン標本による検討から、特異的なBK-LTの検出が可能であることを確認している。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究の目的は、常在性・不顕性感染のBKウイルスに着目し、膵炎の発症に関係する証拠を得ることである。BKウイルスタンパク質が膵炎発症の原因になりうることのエビデンスを取得するために、ドキシサイクリン(DOX)依存的にBKウイルスのLarge T(BK-LT)抗原を膵臓特異的に発現するトランスジェニックマウスを作製していたが、本年度に実施した膵臓組織の病理組織学的もしくは遺伝子生化学的な検討結果を得たことで、BK-LTタンパク質発現と膵炎発症とが関連することを確認できた。
当初の計画どおりの進展が見られたと判断した個別の理由は、本年度の検討で、１）再現性を確認し、BK-LTタンパク質発現と膵炎発症の関連が確実であると判断できるエビデンスを取得できたためである。さらに、２）2020年に予定していた検討はすべて開始しただけでなく、３）2021年度以降に予定していた検討についても前倒しでスタートできたため、当初の計画どおりの進展が見られたと判断している。
|
| 今後の研究の推進方策 |
① DOX誘導BK-LT膵炎マウスの病理学的解析では、2020年度に当初計画していた所見については概ね取得出来たと考えている。このため、2021年度は②、③について重点的に取り組む。
②DOX誘導BK-LT膵炎マウスの免疫学的解析では、DOX誘導BK-LT膵炎マウスの作製と7、14、28日目に出現する炎症細胞のFACS解析を行うとともに、28日目に出現する炎症細胞を対象にしたsingle cell RNA-seq 解析での評価を行い、慢性膵炎を惹起するT細胞性免疫応答のメカニズムに迫る。
③ヒト膵組織と細胞を対象にしたBK-LT 抗原の検出と炎症応答の検討では、BK-LTを特異的に検出できるモノクローナル抗体を用いたヒト膵組織の解析を進める。
DOX誘導BK-LT膵炎マウスに高脂肪食を投与して行う検討については、新型コロナ感染対策のために、マウスの繁殖と導入が制限されるとともに、マウスの飼料の確保が困難となったため、2021年度の実施予定とした。このため、28日目に出現する炎症細胞を対象にしたsingle cell RNA-seq 解析は、高脂肪食投与と非投与群とを比較することで、食餌による免疫応答への影響を明らかにすることを目指す。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度は新型コロナ感染対策の影響もあり、マウスの飼料の確保・保管が困難となった。合わせて、動物実験の規模縮小の指示があり、次年度使用額が生じた状況となっている。一方で新年度となり、研究棟の引っ越しも完了してマウスの飼料の確保・保管に問題ない状況となった。また、十分な匹数を使用し確保できる見込みとなったため、当初の計画分の解析は可能となると考える。
|
