| 研究課題/領域番号 |
20K08392
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| 研究機関 | 名古屋市立大学 |
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研究代表者 |
野尻 俊輔 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (50381843)
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| 研究分担者 |
三浦 裕 至学館大学, 健康科学部, 教授 (90285198)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | ｐ68 / 肝発癌 |
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| 研究実績の概要 |
細胞培養実験と動物実験を並列で進めている。
細胞培養実験 ：まず3種類のヒト培養細胞の培養を始めた。ヒト内皮細胞培養はヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞(HUVEC)を正常内皮細胞として使用し、ヒト星細胞(LX-2).ヒト平滑筋細胞(PCS-100)を星細胞はMEM溶液で、平滑筋細胞は専用培地にて培養した。培養状態は比較的良好で継代に成功している。
次にヒト内皮細胞におけるp68 の強制発現及びノックダウンを試みた。HUVEC細胞を使用しp68強制発現とsiRNAによる遺伝子ノックダウンを施行した。両者ともヒト肝細胞で使用したものを同じプロトコールで使用した。強制発現、ノックダウンともに肝細胞使用時に比べ効率が悪く条件を変えて試行したが発現変化による変化を見るのに十分な状態には至っていない。引き続き現在十分となる効果が得られる条件を検索中である。強制発現系では細胞間による発現効果の差が激しく安定した効果が得られにくいため、siRNAでのノックダウンが十分であれば正常細胞とノックダウンでの差で実験を進めることとする。効果が十分であることを確認したのちに網羅的遺伝子解析を施行したい。
コンディショナルノックアウトマウス（cKOマウス）の作製はfloxp/p68のホモF1マウスとAlb-CreホモF1マウスを交配させcKOマウスを選別することに成功し
た。実際に出来上がったKOマウスを使用し肝臓でのp68KOを確認したのちホモでの継代を継続することに成功している。DENとCCl4の腹腔内投与による肝発癌を誘発するため現在投与観察中である。またDEN単独投与での発癌も文献では多数報告されているため両方法で進めているがDEN飲水法による発癌が一番ばらつきが少なく現在同方法にて発癌進行中である。3か月以内には網羅的解析に進めると予定している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
細胞培養でのｐ68強制発現が実験間細胞により結果にばらつきがある。現在安定するように検討中である。遺伝子ノックダウンについては比較的安定した結果が得られているので今後安定したら網羅的解析へ進みたい。
動物実験は肝臓のｐ68コンディショナルＫＯマウスが出来上がったため現在発癌実験に移行している所である。発癌にの方法を色々試した結果最終的に飲水法が良いことが分かったため発癌実験中で間もなく結果測定となる予定です。
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| 今後の研究の推進方策 |
細胞培養は至適条件を見つけ結果を安定させて遺伝子発現変化の網羅的解析を施行予定です。さらに平滑筋細胞、星細胞との共培養の実験も最終年度でありどうにか進めたいと考えています。
動物実験は順調に進んでいますが発癌のめどがついたため現在最終的な段階に入っています。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
ノックアウトマウスを作成し安定した個体数を得るために時間を要した。また、安定した肝発癌を得るために複数の方法を試す必要があったためさらに時間を必要とした。現在、安定した肝癌を得られる条件を確定したため実験の最終段階である。マウスから得られた組織を使用して遺伝子及び蛋白レベルで網羅的解析を委託する予定のため、まとまった金額を用意している。
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