| 研究課題/領域番号 |
20K08485
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| 研究機関 | 国立研究開発法人国立循環器病研究センター |
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研究代表者 |
若林 真樹 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, オープンイノベーションセンター, 室長 (70552024)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | プロテオミクス / 翻訳後修飾解析 / 心内膜心筋生検 / FFPE / LC-MS |
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| 研究実績の概要 |
本年度は、マウスから摘出したホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）心筋組織に対して昨年度に開発した極微量試料の前処理手法を適用することで、網羅的翻訳後修飾解析を可能とする手法の開発を試みた。
リン酸化プロテオーム解析については、前年度に開発したキャピラリーカラム内でのリン酸化ペプチド濃縮法を適用することで、FFPE組織切片一枚程度でも十分に分析可能であることが分かった。ただし、脱パラフィンの過程で試料のロスを避けることができず、感度が30-50%程度に低下してしまうことが多かった。より高深度な分析を可能とするためには脱パラフィン過程の省略などにより試料回収量の改善を目指す必要がある。
その他翻訳後修飾の網羅的解析についても、PEAKSソフトウェアによるPEAKS PTMサーチやオープンサーチにより、数十種類の修飾を同定することは可能であったが、同定精度や感度は低く、何らかの形で試料の濃縮や試料分離性能の向上が必要であると考える。例えば、ヒストンについては前処理として抗体による濃縮を行うことで、既知修飾のみならず、新規な修飾を複数同定することが可能であり、定量評価を行うことも可能となった。各種翻訳後修飾の定量解析結果については、ウエスタンブロットなどによる検証も進めている。
今後はさらに、多段階のキャピラリーカラム内分離による網羅性の向上などを試みる予定である。また、比較条件が整ったヒト試料が入手可能となり次第、分析を開始する予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
網羅的翻訳後修飾解析手法の確立に向けて試料の前処理手法の改善やサンプルデータの取得も進んでおり、おおむね計画通りに進行していると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
（１）今年度までに構築した手法のさらなる高感度化（試料ロスの極限的低減）にむけて引き続き前処理手法の最適化を行う。
（２）キャピラリーカラムを用いた前処理手法の再現性を向上するために、カラム作製手法についても可能な限り自動化を試みる。特に、多段階の分離手法の確立に向けて、試料のロスや再現性の欠落が起こらない手法の構築を目指す。
（３）基本的な分析・解析手法は整いつつあるため、比較条件が整った試料が入手出来次第、生検試料の分析を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
変らないCOVID-19の情勢により、希望通り入手できない器具類、試薬類が非常に多く、購入を見送った。実験動物も希望通りの納入とならなかったため、維持している既存の実験動物を用いた。LCーMS用消耗品に関して、高価なLC-MS消耗品が多数必要となる予定であり、当初申請額に相当する物品の購入もすでに予定しているため、おおむね使用予定は決定している。
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