| 研究課題/領域番号 |
20K08488
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
東邦 康智 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (10586481)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 心不全 / RNA代謝 / RNAヘリカーゼ |
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| 研究実績の概要 |
2020年度は、ラット新生児由来心筋細胞を用いたRNAヘリカーゼの機能解析と遺伝子改変マウスの作成を行った。
まず、標的とするRNAヘリカーゼが心筋細胞活性や機能に与える影響を評価するため、RNAヘリカーゼをレンチウィルスベクターを用いて過剰発現またはsiRNAでノックダウンし、RNA-seqによりトランスクリプトーム解析を行った。また、RNAヘリカーゼの標的RNAを同定するため、FLAGタグで標識したRNAヘリカーゼをレンチウィルスベクターで導入して過剰発現させた心筋細胞を用いてRIP-seq解析に取り組んだ。さらに、RNAヘリカーゼの機能制御機構を明らかにするため、FLAGタグ標識RNAヘリカーゼをレンチウィルスベクターで導入して過剰発現させた心筋細胞を用いてIP-MS法による結合蛋白質の解析に取り組んだ。RIP-seq及びIP-MSによる解析は現在進行中であり、すでに結果を得ているRNA-seqのデータと統合して、標的とするRNAヘリカーゼの機能及びその制御機構を明らかにする予定である。
遺伝子改変マウスは、心筋細胞特異的RNAヘリカーゼ過剰発現マウスと標的とするRNAヘリカーゼのfloxマウスの作成に取り組んだ。前者を作成するため、α-MHCプロモーターの下流に標的とするRNAヘリカーゼを配置したコンストラクトを作成した。後者については、gRNAとssODNを設計及び作成し、CRISPR技術を用いたLoxP配列の導入を試みている。1回目のインジェクションでは目的とするマウスを得られず、2回目のインジェクションを行った。現在、マウスの出生を待っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本年度は標的とするRNAヘリカーゼの結合RNAをRIP-seqを用いて同定する予定であったが、統合的解析を念頭に、RNA-seqによるトランスクリプトーム解析を先行させた。その結果、RIP-seqによる解析はまだ終了していない。しかし、来年度予定していたIP-MS法によるプロテオーム解析に関してはサンプル採取は終了し、解析段階に入っている。よって、ラット新生児由来心筋細胞を用いた解析はおおむね順調に進んでいる。
遺伝子改変マウスの作成に関しては、1回目のインジェクションにて目的とするマウスを得られなかったことから、2回目のインジェクションを行っており、予定よりやや遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在解析段階にあるRIP-seq解析及びプロテオーム解析の結果と、すでに得られているトランスクリプトーム解析の結果を統合し、標的とするRNAヘリカーゼの結合RNA及び結合蛋白質を明らかにする。得られたデータから主要な結合RNA及び結合蛋白質を同定し、それらの機能解析を通じてRNAヘリカーゼの機能及びその制御機構を明らかにする。
また、引き続き遺伝子改変マウスの作成を試みる。目的とするマウスを得た後、様々な心不全モデルを用いて、心不全の病態生理におけるRNAヘリカーゼの役割を検証する。
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