研究課題
低分子量G蛋白Rhoのエフェクター分子であるRho-kinase（ROCK）にはROCK1、ROCK2という二つのアイソフォームが存在する。本研究では糖尿病の腎組織から蛋白を抽出し、両ROCKアイソフォームとも糖尿病の腎組織で活性化されることを免疫沈降法とウエスタンブロットで確認した。尿細管間質にはROCK2アイソフォームが高度に発現しており、この意義を解明するため、我々が独自に樹立したROCK2 floxマウスと、腎尿細管上皮細胞にCre recombinaseを発現するSlc5a2-Creマウスを交配し、尿細管上皮細胞特異的ROCK2欠損マウス(TR2KO)を作製した。TR2KOはメンデルの法則に従って出生し、成長発達過程に異常は認められないが、尿電解質や電解質トランスポーターの発現レベルに変化を認め、この意義を解明すべく検討を進めている。
2: おおむね順調に進展している
ROCK2 floxマウスと、腎尿細管上皮細胞にCre recombinaseを発現するSlc5a2-Creマウスを交配し、尿細管上皮細胞特異的ROCK2欠損マウス(TR2KO)の作製、維持に成功している。TR2KOの表現型解析もおおむね予定通りに進行している。
尿細管上皮細胞特異的ROCK2欠損マウス(TR2KO)の腎機能と尿細管間質の形態を観察し、ROCK2欠損によって生じる表現型解析をさらに進める。次に、TR2KOに対し、膵β細胞を破壊するストレプトゾトシンを腹腔内投与することで、インスリン欠乏を主徴とする1型糖尿病モデルマウスを作製する。尿中アルブミン排泄量の増加と腎組織の形態学的変化から、腎症の発症・進展における尿細管ROCK2の役割を明らかにする。間質病変が顕著に見られない場合は、片側尿管結紮による負荷を加える。さらに、レプチン受容体に変異を持つdbマウスとの交配から、インスリン抵抗性を呈する2型糖尿病モデルマウスを作製する。dbマウスとの交配が予定通り進まない場合は、60%高脂肪食投与によって腎症を誘導する。尿中アルブミン排泄量と腎組織形態の変化から、糖尿病の病型を問わず、ROCK2が腎症進行に関与するか否かを検討する。マウス腎組織から尿細管上皮細胞を分取し、RNA-Seqによる遺伝子発現プロファイリングを行う。ROCK2欠損によって変化するtranscriptomeから、尿細管間質病変の表現型差異を決定する遺伝子群を同定する。また、脂肪酸を基質として利用するミトコンドリア呼吸の変化をflux analyzerを用いて明らかにする。
尿細管上皮特異的ROCK2欠損マウスの作製と表現型解析に取り組んだが、解析が順調に進んだため、動物飼育費と遺伝子型解析費に未使用額が生じた。
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