| 研究課題/領域番号 |
20K08646
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| 研究機関 | 弘前大学 |
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研究代表者 |
赤坂 英二郎 弘前大学, 医学部附属病院, 助教 (30436034)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 栄養障害型表皮水疱症 / 線維化 / TGF-beta / VII型コラーゲン / マトリックスメタロプロテイナーゼ / インテグリン / トロンボスポンディン-1 / 活性酸素 |
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| 研究実績の概要 |
劣性栄養障害型表皮水疱症(RDEB)では、真皮と表皮の接着に必須な係留線維の主成分であるVII型コラーゲン (C7) の遺伝的異常により、真皮表皮の接着が脆弱となり、軽微な外力で全身の皮膚粘膜に水疱・びらんを形成する。また皮膚損傷と瘢痕治癒のサイクルを繰り返すことで、指趾の棍棒状癒着、関節拘縮、食道狭窄など著明な線維化をきたすことが特徴である。RDEBに対する有効な治療法は存在しない。
一般に、種々の臓器の線維化はTGF-βシグナルにより引き起こされる。RDEBにおいてもTGF-βを標的とした治療でRDEBにおける皮膚線維化を抑制することができると考える。そのためには、RDEBの疾患特異的なTGF-βシグナル活性化機構を解明しなければならない。TGF-βは非活性型のLatent TGF-βとして分泌され、Latent associated protein (以下LAP) からmature TGF-βが切り離されることで活性型となる。このLatent TGF-βの活性化はプロテアーゼ、インテグリン、トロンボスポンディン1(TSP-1)、活性酸素などの様々な因子により促進されることが知られている。われわれは、これらの因子がRDEBにおいてどのようにTGF-βシグナル活性化に関与しているか検討した。まずRDEB患者皮膚線維芽細胞および皮膚角化細胞を用いて、TGF-βシグナルが健常人由来の線維芽細胞や角化細胞と比較して、TGF-βシグナルが活性化し、線維化関連タンパクの発現が亢進しているいことを明らかにした。さらに、各種活性化因子の阻害剤やsiRNAを用いて、主たる活性化メカニズムを同定した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
培養細胞を用いた実験系では、RDEB皮膚線維芽細胞（RDEBF）と正常皮膚線維芽細胞(NHF)をLatent-TGF-βで刺激した場合、RDEBFではTGF-βシグナル活性が有意に上昇していた。一方、両者を活性型TGF-βで刺激した場合、TGF-βシグナル活性に差はみられず、RDEBFではLatent-TGF-β活性化機構が亢進していると考えられた。各種TGF-βシグナル活性化因子（マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)、RGD結合インテグリン、トロンボスポンディン-1(TSP-1)、活性酸素(ROS))の発現量や活性は、RDEBFやRDEB角化細胞(RDEBK)において、健常皮膚由来培養細胞と比較して総じて有意な上昇がみられた。各種TGF-βシグナル活性化因子の阻害剤を用いたウエスタンブロットおよびコラーゲンゲル収縮アッセイでは、ROS阻害剤がTGF-βシグナル活性を抑制した。各種活性化因子のSiRNAを用いた実験では、MMP-2およびインテグリンβ5のSiRNAがRDEBFのTGF-βシグナル活性を有意に抑制した。また線維芽細胞と角化細胞の共培養において、RDEBFはRDEBKと共培養した場合、正常角化細胞(NHK）と共培養したものと比較して優位にTGF-βシグナル活性が上昇していた。またこれら共培養系ではMMP-9発現がRDEBK-RDEBF共培養において有意に上昇しており、MMP-9阻害剤によりこの共培養系のTGF-βシグナル活性は著明に抑制された。このことから、RDEB皮膚においてはMMP、RGD結合インテグリン、ROSがTGF-βシグナル活性の重要な因子であることが示唆された。さらにRDEBKとRDEBFは互いにTGF-βシグナル活性の高発現を介したクロストークにより、RDEB皮膚の線維化を亢進していると考えられた。
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| 今後の研究の推進方策 |
RDEBFでコラーゲンVII(C7)欠損により最終的にTGF-βシグナルが亢進することから、C7はLatent TGF-β活性化因子の発現や機能を抑制することで、TGF-βシグナルを制御していると考えられる。この機構を明らかにするため、C7およびI型コラーゲンでコーティングしたディッシュ上で培養したNHF、RDEBFをLatent-TGF-βで刺激し、TGF-βシグナル活性をウエスタンブロットで検討したところ、C7コーティングで優位な低下がみられた。この低下は活性型TGF-β刺激ではみられなかった。したがってC7自体にLatent-TGF-β活性化の抑制作用があると考えられた。今後は、Recombinant FLAG-type VII collagenを過剰発現させたRDEBF、3) shRNAでC7をKnock-downしたNHFを用いて、MMP、RGD結合インテグリン、ROSとC7の相互作用を、Proximity ligation assay、免疫沈降、Binding Assayなどで検討しようと考えている。
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