| 研究課題/領域番号 |
20K08657
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| 研究機関 | 岐阜薬科大学 |
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研究代表者 |
井上 紳太郎 岐阜薬科大学, 薬学部, 特任教授 (00793853)
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| 研究分担者 |
水谷 有紀子 岐阜薬科大学, 薬学部, 特任准教授 (30396296)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | ロドデンドロール / 白斑 / GPNMB / NRF2 / 酸化ストレス / 細胞障害性 / 表皮細胞 |
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| 研究実績の概要 |
ロドデンドロール(RD)による色素脱失症発症にはRD由来代謝物による酸化ストレス(OS)が寄与している。一方、尋常性白斑(VL)の発症と病態維持にもH2O2などに対するOS感受性が関わっており、その実態解明が化学白斑やVLの発症予防、治療に重要である。色素細胞(MC)のOS抵抗性にはNRF2系が寄与しているが、メラニン合成、ストレス抵抗性、および細胞接着に関わる膜タンパク質(GPNMB)が表皮基底層で発現するのに対し、VL由来基底層では消失していることを最近見出した(Biswas et al., Sci Rep 10: 4930 (2020))。本研究では、VL発症に関連するIFN-γやIL17AがGPNMB発現を抑制したことから、OS抵抗性へのGPNMBの関与やNRF2抗酸化システムとの関係性をMCやメラノーマ細胞(MM)、および表皮細胞(KC)で明らかにする。
NRF2-ノックアウト(KO) ヒトMM株を作出し検討した結果では、GPNMB-siRNAによりGPNMBをノックダウンしたときRDやH2O2に対する細胞障害性が増し、細胞外ドメインからなる組換え型(r)GPNMB添加により細胞障害性が軽減された。GPNMB受容体候補であるNa＋/K＋ATPaseαサブユニットについては、ウアバインでその効果を阻害できなかったことから、他の受容体の可能性を検討する必要がある。
VL発症および病態維持におけるヒトKCでのGPNMBの寄与を調べる目的で、まず、MMで認められたOS抵抗能について調べた。ヒトKCでは、NRF2をノックダウンしてもH2O2感受性に変化なかったが、GPNMBノックダウンによりH2O2感受性が増した。さらに、rGPNMBはKCのH2O2による細胞障害性を軽減させた。以上の結果は、MMのみならずKCにおいてもGPNMBがOS抵抗性に寄与することを示唆した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
前年度の検討で、KCの増殖期では抗酸化システムとして重要なNRF2が機能しておらず、むしろGPNMB（白斑病変部KCでの発現が消失する）がOS抵抗性に寄与していることが示された。そこで、KCのGPNMB発現低下が白斑発症や病態維持にどう関わっているのか、あるいはGPNMBがKCでどのような生理的役割を担っているのかについて詳細な検討に着手した。尋常性白斑病変部の基底層KCではGPNMBが発現していないことから、in vitroで培養ヒト正常KCのGPNMBタンパク質をノックダウンし、部分的に細胞障害性を示す濃度(細胞生存率が約80％)のH2O2処理ありなしの条件下で変動する遺伝子について網羅的にRNA配列解析し、発現変動している遺伝子を解析した。その中で、白斑病変部でMCが基底膜から離脱し浮き上がる(floating melanocytes)要因と考えられる接着因子に着目した。GPNMBのノックダウンにより、白斑メラノサイトでの発現低下が報告されているE-カドヘリン (CDH1) の発現量はKCでは変わらなかったが、インテグリンβ1 (ITGB1)およびラミニンβ1 (LAMB1) ｍRNA発現が有意に低下し、GPNMB発現低下時にH2O2による酸化ストレスが加わるとさらに発現量が低下した。WB解析によるタンパク質発現量でも同様の結果が得られた。この結果は、KCのインテグリンα3β1および基底膜ラミニン511発現量の低下を示唆する。KCα3β1はMCのGPNMBと結合し、MCはα6β1を介して基底膜ラミニン511と結合すること、さらにKCのGPNMBはMCのα3β1と結合することから、白斑部位のKCでのGPNMB発現低下時にOSに曝されると、KCとMCの結合、およびMCの基底膜との結合が低下し、floating MC形成を促す可能性が示唆された。
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| 今後の研究の推進方策 |
検討の結果、IFNγやIL17A によるKCのGPNMB発現減少時にOS刺激を受けると、KCのインテグリンやラミニン発現の低下を介して白斑病態で見られるfloating melanocyteの形成に関与する可能性が示された。次年度は、培養ヒト正常KCを用いて、
１）なぜKCのGPNMBノックダウンによってOS感受性が増すのかを、抗OSシステムに関わる遺伝子やタンパク質発現、およびアポトーシスの誘導や抵抗性に関わる遺伝子やタンパク質発現の動態を調べる。
２）健常皮膚の基底層KCで発現しているGPNMBの生理的役割を明らかにするために、増殖、分化に及ぼす影響を調べる。
３）尋常性白斑では紫外線（UV）療法が用いられているが、一方でメラニン不在にも関わらずUVによる発ガンリスクは低下することが知られている。そこで、KCにUVBを照射したときのGPNMB発現変化や遊離型GPNMB量変化、およびGPNMBノックダウン時の発癌や発癌抑制遺伝子の発現変化について解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
納品が年度内に間に合わなかったため。繰り越し分は4月納品予定の発注分の支払いに充てる。
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