ヒトiPS細胞由来メラノサイトでの白斑治療・悪性黒色腫解明・美白物質の研究

2020 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 20K08660
• 研究機関: 東北医科薬科大学
• 研究代表者: 川上 民裕 東北医科薬科大学, 医学部, 教授 (20297659)
• 研究期間 (年度): 2020-04-01 – 2023-03-31
• キーワード: メラノサイト / iPS細胞 / 白斑 / 悪性黒色腫 / 美白物質 / ケラチノサイト

研究実績の概要

１．ヒトiPS細胞の培養維持 京都大学iPS細胞研究所(CiRA)、理化学研究所よりヒトiPS細胞（1383D6 HPS1006）を入手して、培養の維持をしている。さらにかつて本研究に使用した健常人成人男性（40歳日本人）からの採血により獲得したTリンパ球由来のヒトiPS細胞を再度、入手をすすめている。
２．ヒトiPS細胞をメラノサイトへ誘導 Stem cell factor・BMP4・Wnt3a・ET1・ｂFGF・αMSH・DBｃAMP・チロシン・トランスフェリン・アスコルビン酸・活性型ビタミンD3など特許を取得した独自培地であるHuman iPS cell-derived melanocyte medium (iDMM)を使用し、メラノサイトへの誘導をすすめている。2週間の短期間でCiRAから購入したヒトiPS細胞をメラノサイトに変化させることができた。
３．ヒトiPS細胞由来メラノサイトの検証 DNAマイクロアレイでの網羅的遺伝子発現プロファイルで正常メラノサイトとの相同性が非常に高いことを証明した。RT-PCRを使用して、Pax3、NANOG（iPS細胞マーカー）、Mitf、Kit、チロシナーゼ、Trp-1、Trp-2（メラノサイトマーカー）の発現レベルを確認している。
４．美白化粧品の主成分物質の作用を検証 美白化粧品のコウジ酸以外の候補物質を検証している。しかし、メーカーとの協力体制が充分構築されていない。
５．ヒトiPS細胞由来メラノサイトとケラチノサイトとの共培養 正常ヒトケラチノサイトとの共培養を行った。細胞数の条件は、メラノサイト1に対してケラチノサイト10であり、培養液はメラノサイト培養液1に対してケラチノサイト培養液2が、最も良好であることを確認した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

１．ヒトiPS細胞の培養維持 京都大学iPS細胞研究所(CiRA)、理化学研究所よりヒトiPS細胞（1383D6 HPS1006）を入手・培養の維持は予定通りである。さらにかつて本研究に使用した健常人成人男性（40歳日本人）からの採血により獲得したTリンパ球由来のヒトiPS細胞を再度の入手は進んだ進展と理解している。２．ヒトiPS細胞をメラノサイトへ誘導 2週間の短期間でCiRAから購入したヒトiPS細胞をメラノサイトに変化させることができた。特許を獲得した独自培地（Human iPS cell-derived melanocyte medium；iDMM)は、数週間でヒトiPS細胞から成熟したヒトメラノサイトが産生される。開発はすすみ、advanced iDMMが完成し、ヒトiPS細胞をadvanced iDMM で培養することで、たった2週間でメラノサイトに分化誘導することに成功した。
３．ヒトiPS細胞由来メラノサイトの検証 RT-PCRを使用は安定した実験系となった。
４．美白化粧品の主成分物質の作用を検証 美白化粧品のコウジ酸以外の候補物質を検証している。しかし、メーカーとの協力体制が充分構築されていない。
５．ヒトiPS細胞由来メラノサイトとケラチノサイトとの共培養 正常ヒトケラチノサイトとの共培養を行った。細胞数の条件は、メラノサイト1に対してケラチノサイト10であり、培養液はメラノサイト培養液1に対してケラチノサイト培養液2が、最も良好であることを確認した。この実験系は、臨床に近い状態といえる。皮膚生検からメラノサイトを分離し、培養で大量産生されることは困難な技術とされている。しかし、患者からのメラノサイト単離培養 白斑患者の皮膚生検による皮膚採取から、メラノサイト単離培養に成功した。

今後の研究の推進方策

１　白斑患者の採血からのヒトiPS細胞の樹立を目指す。
２　白斑患者の皮膚生検による皮膚採取から、メラノサイト単離培養に成功した。すなわち、皮膚採取メラノサイト単離培養細胞株が確立したので応用していく。
３　ヒトiPS細胞由来メラノサイトと皮膚採取メラノサイト単離培養細胞を比較検証する。対象は、A）メラニン生成能評価　B）メラノソームトランスファー評価　C）過酸化水素耐性能評価（MTSアッセイ）　D）過酸化水素消去能評価（培養細胞を用いたオリジナル評価法）　E）RNA抽出からのシークエンス解析　以下、オプションとして、・ATP産生能評価　・解糖能（乳酸産生能）評価　・グルコース消費量評価　・メラノサイト活性化剤（胎盤エキス）の有用性評価

次年度使用額が生じた理由

当初予定していた研究補助員への支払予定金額よりも、実際の支出金額が下回った。
研究の進捗自体は順調であるため、来年度も引き続き研究補助員への支出金額として使用を続けていく。

研究成果

• [雑誌論文] Establishment of co-culture of human induced pluripotent stem (iPS) cell-derived melanocytes and keratinocytes in vitro. (2021)
  • 著者名/発表者名: Kawakami T, Komatsu T, Yokoyama K, Iwama E, Dong Y.
  • 雑誌名: J Dermatol. 巻: 48 ページ: 123-125
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Relationship between lysosomal-associated membrane protein-2 and anti-phosphatidylserine/prothrombin complex antibody in pathogenesis of cutaneous vasculitis. (2020)
  • 著者名/発表者名: Kawakami T, Kikuchi A, Miyabe C, Ikeda T, Takeuchi S, Tamura Y, Nishibata Y, Masuda S, Nakazawa D, Tomaru U, Ishizu A.
  • 雑誌名: Clin Exp Rheumatol. 巻: 38 ページ: 161-165
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Clinical characteristics and social productivity levels of patients with malignant rheumatoid arthritis based on a nationwide clinical database in Japan: annual survey from 2003 to 2013 (2020)
  • 著者名/発表者名: Abe Yoshiyuki、Saeki Keigo、Dobashi Hiroaki、Kawakami Tamihiro、Hayashi Taichi、Kobayashi Masaki、Kaname Shinya、Harigai Masayoshi、Tamura Naoto
  • 雑誌名: Modern Rheumatology 巻: 31 ページ: 1～8
  • DOI: 10.1080/14397595.2020.1795390
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Skin biopsies using dermoscopy for earlier diagnosis of intravasculer large B-cell lymphoma. (2020)
  • 著者名/発表者名: Miyabe C, Nomura J, Ikeda T, Takahashi K, Kawakami T.
  • 雑誌名: J Dermatol. 巻: 47 ページ: e276-e278
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Pityriasis lichenoides et varioliformis associated with anti-Ku positive refractory interstitial lung disease and dermatomyositis. (2020)
  • 著者名/発表者名: Ikeda T, Shirota Y, Iwama E, Yokoyama K, Takahashi K, Kawakami T.
  • 雑誌名: J Dermatol. 巻: 47 ページ: e403-404
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Wound, pressure ulcer and burn guidelines-1: Guidelines for wounds in general, second edition. (2020)
  • 著者名/発表者名: Hasegawa M, Inoue Y, Kaneko S, Kanoh H, Shintani Y, Tsujita J, Fujita H, Motegi S, Pavoux AL, Asai J, Asano Y, Abe M, Amano M, Ikegami R, Ishii T, Isei T, Isogai Z, Ito T, Irisawa R, Iwata Y, Otsuka M, Omoto Y, Kato H, Kadono T, Kawakami T, et al.
  • 雑誌名: J Dermatol. 巻: 47 ページ: 807-833
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Clinical practice guide for the treatment of perforating dermatosis. (2020)
  • 著者名/発表者名: Kawakami T, Akiyama M, Ishida-Yamamoto A, Nakano H, Mitoma C, Yoneda K, Suga Y.
  • 雑誌名: J Dermatol. 巻: 47 ページ: 1374-1382
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Establishment of human iPS cell-derived melanocyte as potential source for melanocyte regeneration. (2020)
  • 著者名/発表者名: Kawakami T.
  • 学会等名: The XXⅣInternational Pigment Cell Conference
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Dermatological perspective on eosinophilic granulomatosis with polyangiitis (EGPA), including the MIRRA study (mepolizumab, an anti-IL-5 antibody treatment). Mepolizumab EGPA seminar. (2020)
  • 著者名/発表者名: Kawakami T.
  • 学会等名: The XXⅣ International Pigment Cell Conference
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Establishment of co-culture of human induced pluripotent stem (iPS) cell-derived melanocyte and keratinocytes in vitro. (2020)
  • 著者名/発表者名: Kawakami T, Komatsu T, Yokoyama K, Ikeda T, Takahashi K, Dong Y.
  • 学会等名: The 45th Annual Meeting of the Japanese Society for Investigative Dermatology.
  • 国際学会
• [学会発表] 今後の治療法 白斑の病態と治療 (2020)
  • 著者名/発表者名: 川上民裕
  • 学会等名: 第119回日本皮膚科学会総会
  • 招待講演