| 研究課題/領域番号 |
20K08662
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| 研究機関 | 近畿大学 |
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研究代表者 |
森山 麻里子 近畿大学, 薬学総合研究所, 准教授 (40595295)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 皮膚 / 乾癬 / Notchシグナル |
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| 研究実績の概要 |
当該年度は、表皮特異的Hes1cKOマウスでのイミキモド誘発性乾癬モデルでの乾癬悪化に関与する免疫細胞の同定についての再現性実験を行った。特にイミキモド誘発性乾癬モデル表皮での免疫細胞について、それぞれの免疫細胞を解析した。昨年度はイミキモド塗布7日目の結果を見ていたが、今回は比較的早い段階での同定を行った。結果、イミキモド塗布2日目から既にマクロファージの真皮への浸潤が多いことが明らかとなった。さらに、免疫染色により、2日目には表皮でのγδT細胞が活性化している様子が認められ、数も若干Hes1cKOで多いことが観察された。
また、表皮特異的Hes1cKOマウス表皮でどのようなシグナルが活性化しているのか解析するため、定常状態、創傷3日目、イミキモド塗布後3日目のコントロールマウス表皮ならびに表皮特異的Hes1cKOマウス表皮からRNAを精製し、RNA-seqによる網羅的遺伝子発現解析を行った。現在得られたデータより、乾癬発症Hes1epicKOマウスで発現の変動する遺伝子に関して定量的PCRでの検証を行い、Hes1cKOマウスではIL1AとIL23Aの発現量が上昇していることを明らかとした。また、表皮特異的Hes1cKOマウスにおける炎症性サイトカイン発現の上昇が直接的なものか、バリア機能破綻による二次的要因であるか確かめるために、Hes1epicKOマウス皮膚より表皮ケラチノサイトを樹立した。イミキモドで処理した際、上記遺伝子が上昇することをqPCR法にて確かめた。また、別のTLR刺激剤であるPam3Cys-Ser-(Lys)4で処理した際にも、同様にIL1A, IL23Aが上昇することを確かめた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究課題では、表皮におけるHes1の発現が皮膚免疫を調節する可能性について、そのメカニズムも含めて解明したい。具体的には、表皮特異的Hes1コンディショナルノックアウトマウス（Hes1epicKO）を用い、創傷治癒、乾癬発症時における解析を行うと考えていた。また、当該年度には以下のことを明らかにしようと計画していた。
（1）創傷治癒、乾癬発症時において、皮膚に浸潤する免疫細胞の同定と局在を明らかにする
(2) 表皮ケラチノサイトに発現する遺伝子の網羅的発現解析を行い、そのバリデーションを行う。
（3） Hes1cKOマウス由来表皮ケラチノサイトでのin vitro実験を行う
(1)に関しては、さらにN数を増やし、有意差検定も行った。さらに、当初の計画にはなかったが、乾癬の症状が出る以前での検証も行い、ある程度の結果を得ている。（2)に関しては、バリデーションは終了し、IL1AとIL23Aなどの遺伝子群が有意に上昇していることを確かめた。（3）に関しては、現在行っているところではあるが、vivoの結果と同様、IL1AとIL23A遺伝子が有意に上昇していることを確かめている。
以上のことから、本研究課題はおおむね順調に伸展していると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
マウス個体による個体差が大きな案件であるので、免疫細胞の局在や種類について、さらにN数を増やして検討を行う。また、浸潤量に違いが見られた免疫細胞についてはwhole mount染色や皮膚切片での免疫染色を行い、その局在についても確かめる。特に、症状が出てきていない早い段階（イミキモド塗布1日目、2日目）での検証を行いたい。
また、RNA-seq解析により得られた遺伝子に対し、その上昇メカニズムについて解析を行いたい。NF-κBなどのシグナル伝達経路に着目し、ウェスタンブロッティングや免疫染色法を用いた検証を行いたい。
さらに、Hes1epicKOマウス皮膚より表皮ケラチノサイトを樹立し、in vitroの系での検証についても、N数を増やして再現性を取りたい。また、vivoでの実験に合わせ、シグナル伝達経路に着目した検証も行う。また、Hes1は転写抑制因子であることから、これらの遺伝子を直接的に制御している可能性もあるため、IL1AやIL23Aのプロモーター部分の解析を行い、転写抑制メカニズムについても解析を行いたい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
コロナウイルスの影響から出張がほぼなくなり、旅費として計上していた予算を物品費（FCM、免疫染色用の抗体やqPCRの試薬費）として支出したため、少し予定していた金額と異なった。また、コロナウイルスの影響より、プラスチック製品やニトリル手袋などの消耗品が値上がりしたため、少し次年度に使用額を
生じさせる計画とした。
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