| 研究課題/領域番号 |
20K08678
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| 研究機関 | 自治医科大学 |
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研究代表者 |
津田 英利 自治医科大学, 医学部, 助教 (30414923)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | PTRF/Cavin1 / ケラチノサイト / 乾癬 / Psoriasis |
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| 研究実績の概要 |
まず最初に、研究に使用する、ヒト正常表皮細胞株であるHaCaT細胞のPTRF遺伝子の目的SNPであるrs963986近傍の塩基配列を確認した。PCRで増幅した領域にいくつか報告のあるSNPが確認されたが、本課題で対象にしているrs963986については、正常型で有ることが確認出来た。さらに、PTRFの発現量並びに、発現挙動について、ヒト正常表皮角化細胞の初代培養細胞（NHEKs）と同様か否か、HaCaT細胞にて確認を行った。まず初めに未刺激時のPTRFの発現をNHEKsと比較したところ、HaCaT細胞における未刺激時のPTRFの発現量は、NHEKsと比べてほぼ同等であった。次に、PTRFの発現が刺激によってNHEKsと同様に発現が変化するか確認を行った。そうすると、過酸素条件では発現が上昇し、低酸素条件では発現が減少する、NHEKsと同様の現象が観察された。また、siRNAを用いて、PTRF遺伝子をノックダウンし、細胞増殖に与える影響を観察したが、こちらもNHEKsと同様に影響が無いことが明らかとなった。よって、HaCaTではNHEKsと同様の発現挙動を示すと考えた。次に、rs963986を導入するために、CRISPR/Cas9を用いてゲノム編集を行う必要があるために、まず最初にgRNAとCas9タンパク質が導入可能か否か、ゲノムが切れるか否か、確認を行った。その結果、SNP近傍に設計した3種類のgRNA全てで切断されることが解った。今後はrs963686を導入するために、一本鎖DNAを設計、作成し、ゲノム編集したCas9タンパク質とgRNAを導入した細胞に導入し、スクリーニングを行う予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
昨年、講座飼育のマウスから、SPF環境では検出されてはならない微生物が検出されてしまい、そのクリーンアップの為、マウス系統を一度閉め、飼育環境の消毒と系統の凍結胚からの再構築となったため、新たなマウスを導入することが出来なかった。現在、既存マウスの繁殖計画を立てており、PTRFノックアウトマウスを導入するタイミングを現在検討中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
ゲノム編集したHaCaT細胞を現在スクリーニング中である。マーカーを入れることが出来ないため、単一コロニーからの個々のスクリーニングになるため、時間が少しかかる予定である。その間に、PTRFのGFP融合タンパク質を発現するベクターを構築し、矯正発言させて、生細胞中での局在、刺激による局在変化、等を検討する予定である。また、マウスの導入予定が決まり次第、PTRFノックアウトマウスを導入し、実験に使えるまでに増えたところで、順次乾癬モデルマウスを作成予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度使用予定であったマウスの導入が遅れた為。
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