| 研究課題/領域番号 |
20K08678
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| 研究機関 | 自治医科大学 |
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研究代表者 |
津田 英利 自治医科大学, 医学部, 助教 (30414923)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | PTRF/Cavin1 / SNPs / 表皮細胞 / 乾癬 |
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| 研究実績の概要 |
継代可能な表皮由来細胞株である、HaCaT細胞を用いて、乾癬GWASにて関連が指摘された、PTRF/Cavin1のrs963986の変異導入を試みた。変異の導入にはゲノム編集アイテムである、CRISPR/Cas9システムを用いた。gRNAと変異導入様の2本鎖DNAをトランスフェクションした後に、一定期間培養した。その後、これらの細胞をシングルセルになる様に回収、希釈して96well plateに蒔き直し、1stスクリーニングを行った。まず最初にgRNAを3種類用いて、それらの切れ具合を調べたが、3種類に大きな違いは見られなかった。よって3種類同時に変異導入を試みている。現在、何種類化の欠損株は得られているが、目的のSNPsと全く同じ変異が導入された細胞株は見つかっていない。rs963986近傍に欠損が入った細胞株については、野生型と比べて、細胞増殖性に違いが無いことを確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
予定していたより、変異導入のスクリーニングに時間がかかっている。要因はHaCaT細胞のトランスフェクション効率が、予想より低く、変異導入率が低いことも考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
継続してゲノム編集した細胞のスクリーニングを行う。一部近いところに変異、欠損が見つかった株については、PTRFの発現量や、近傍の遺伝子発現について、変化が無いか確認する。PTRFのノックアウトマウスについては、手に入れる手続きを行い、本学の実験医学センターに納入次第、繁殖させ、乾癬モデルマウスを作成し、野生型と比べたときに違いが出るか否か確認を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
使用、購入した試薬の大幅値引きがあったことと、細胞スクリーニングに時間を要したために、当初予定より少し、実験計画が遅れているため。次年度にはノックアウトマウスを海外から導入予定であり、導入と飼育、試験に重点的に使用する予定である。
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