シングルセル解析による有棘細胞がんの腫瘍内不均一性の起源の探索

2020 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 20K08698
• 研究機関: 日本医科大学
• 研究代表者: 佐伯 秀久 日本医科大学, 大学院医学研究科, 大学院教授 (80235093)
• 研究分担者: 長田 真一 日本医科大学, 医学部, 准教授 (00244484) ; 平谷 伊智朗 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, チームリーダー (40583753)
• 研究期間 (年度): 2020-04-01 – 2023-03-31
• キーワード: 腫瘍内不均一性 / シングルセル解析 / 有棘細胞がん / 上皮間葉転換 / RNA-Seq

研究実績の概要

がんは1つの細胞に由来するが、ゲノム異常の蓄積、微小環境の影響により不均一性を生じる。腫瘍内不均一性は、がんが治療抵抗性を獲得し、再発・転移する分子基盤であると考えられるが、微小環境の影響を解析する方法は確立していない。これまで培養がん細胞は、がん細胞のシグナル伝達、動態、薬剤感受性などの研究に大きな役割を果たしてきたが、培養がん細胞を用いた研究に決定的に欠けているのは、がんの周囲を取り巻く免疫細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞などから構成される、がん微小環境の研究ができないことである。さらにがん微小環境は、このように複数の細胞の相互作用で構築されるので、従来のがん組織を集団（バルク）として捉える研究手法ではなく、個別の細胞ごとに解析する必要がある。すなわち、シングルセル解析の手法を用いて、SCCの微小環境を解析する必要がる。
我々はマウスにできた有棘細胞がん（SCC）から樹立した細胞株を、遺伝的バックグランドが同じマウスに注射することにより (allograft モデル)、SCCを再現する系を独自に確立した。本研究はこの系を用いて、2次元の培養SCC細胞から3次元のSCC組織ができる時に、どのような遺伝子の発現の違いがみられるのかをシングルセル・レベルで比較することにより、がん微小環境によりSCC内に不均一性が生じるメカニズムを明らかにすることを目的とする。
用いる培養SCC細胞が単クローンに由来していなければ、マウスに注射した時にできるSCCは、多クローン性のために不均一性を獲得する可能性がある。そこでこの可能性を否定するために、本年度は培養SCC細胞を単クローン化し、さらにGFP遺伝子を導入して、単クローンに由来する細胞を可視化することを試みた。

現在までの達成度 (区分)

4: 遅れている

理由

新型コロナウイルス感染症のため、半年以上研究室への出入りが制限されていたため、研究計画に遅れが出ている。また、実験に用いる予定だった培養細胞がマイコプラズマに感染していたため、その除去にも時間がかかった。

今後の研究の推進方策

新型コロナウイルス感染症に対する対策をしっかりとることにより、研究室も使用できるようになった。今年度は、昨年度の遅れを取り戻すべく、当初の研究計画の(I)培養SCC細胞にはどの程度不均一性があるのか、(II)2次元から3次元に構築される過程でどのような遺伝子の発現変化が起こるのか、という課題に取り組む。具体的には以下の研究を、当初の計画通り行う。
①単クローン由来の培養細胞を用いた予備実験の検証、②シングルセルを単離する条件の検討、③ライブラリーの作製、④シークエンスとデータ解析。

次年度使用額が生じた理由

コロナ禍の影響で、半年ほど研究できなかった結果、予定していた試薬類の購入費を次年度に持ち越すことになった。今年度はライブラリーの作製、RNA-SEQを予定しており、持ち越し分をその費用に充てる予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Type XVII collagen interacts with the aPKC‐PAR complex and maintains epidermal cell polarity (2021)
  • 著者名/発表者名: Watanabe M, Kosumi H, Osada S-I, Takashima S, Wang Y, Nishie W, Oikawa T, Hirose T, Shimizu H, Natsuga K
  • 雑誌名: Exp Dermatol 巻: 48 ページ: 62-67
  • DOI: 10.1111/exd.14196
  • 査読あり
• [雑誌論文] Delgocitinib ointment, a topical Janus kinase inhibitor, in adult patients with moderate to severe atopic dermatitis: A phase 3, randomized, double-blind, vehicle-controlled study and an open-label, long-term extension study (2020)
  • 著者名/発表者名: Nakagawa Hidemi、Nemoto Osamu、Igarashi Atsuyuki、Saeki Hidehisa、Kaino Hironobu、Nagata Takeshi
  • 雑誌名: Journal of the American Academy of Dermatology 巻: 82 ページ: 823～831
  • DOI: 10.1016/j.jaad.2019.12.015
  • 査読あり
• [雑誌論文] Efficacy and safety of dupilumab in Japanese adults with moderate-to-severe atopic dermatitis: a subanalysis of three clinical trials. (2020)
  • 著者名/発表者名: Katoh N, Kataoka Y, Saeki H, Hide M, Kabashima K, Etoh T, Igarashi A, Imafuku S, Kawashima M, Ohtsuki M, Fujita H, Arima K, Takagi H, Chen Z, Shumel B, Ardeleanu M
  • 雑誌名: Br J Dermatol 183 巻: 183 ページ: 39-51
  • DOI: 10.1111/bjd.18565
  • 査読あり
• [雑誌論文] Japanese guidelines for atopic dermatitis 2020 (2020)
  • 著者名/発表者名: Katoh N, Ohya Y, Ikeda M, Ebihara T, Katayama I, Saeki H, Shimojo N, Tanaka A, Nakahara T, Nagao M, Hide M, Fujita Y, Fujisawa T, Futamura M, Masuda K, Murota H, Yamamoto-Hanada K
  • 雑誌名: Allergol Int 巻: 69 ページ: 356-369
  • DOI: 10.1016/j.alit.2020.02.006
  • 査読あり
• [雑誌論文] Nutrition and psoriasis (2020)
  • 著者名/発表者名: Kanda N, Hoashi T, Saeki H
  • 雑誌名: Int J Mol Sci 巻: 21 ページ: 5405
  • DOI: 10.3390/ijms21155405.
  • 査読あり
• [雑誌論文] ssociations of TNFAIP3 variants with susceptibility to psoriasis vulgaris and psoriasis arthritis in a Japanese population. (2020)
  • 著者名/発表者名: Momose M, Hirota T, Kikuchi S, Inoue N, Umezawa Y, Nakagawa H, Saeki H, Tamari M, Asahina A
  • 雑誌名: J Dermatol Sci 巻: 100 ページ: 220-222
  • DOI: 10.1016/j.jdermsci.2020.09.005
  • 査読あり
• [雑誌論文] Multifaceted Hi-C benchmarking: what makes a difference in chromosome-scale genome scaffolding? (2020)
  • 著者名/発表者名: Kadota M, Nishimura O, Miura H, Tanaka K, Hiratani I, Kuraku S.
  • 雑誌名: Gigascience 巻: 9 ページ: giz158
  • DOI: 10.1093/gigascience/giz158.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Microrheology for Hi-C Data Reveals the Spectrum of the Dynamic 3D Genome Organization. (2020)
  • 著者名/発表者名: Shinkai S, Sugawara T, Miura H, Hiratani I, Onami S.
  • 雑誌名: Biophys J. 巻: 118 ページ: 2220-2228
  • DOI: 10.1016/j.bpj.2020.02.020
  • 査読あり
• [雑誌論文] Mapping replication timing domains genome wide in single mammalian cells with single-cell DNA replication sequencing. (2020)
  • 著者名/発表者名: Miura H, Takahashi S, Shibata T, Nagao K, Obuse C, Okumura K, Ogata M, Hiratani I, Takebayashi SI.
  • 雑誌名: Nat Protoc. 巻: 15 ページ: 4058-4100
  • DOI: 10.1038/s41596-020-0378-5.
  • 査読あり