血管増殖におけるVWF-HBDの同定と抑制型VEGFアイソフォームとの相互作用

2020 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 20K08711
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 松下 正 名古屋大学, 医学部附属病院, 教授 (30314008)
• 研究分担者: 鈴木 伸明 名古屋大学, 医学部附属病院, 助教 (70637686) ; 菊地 良介 名古屋大学, 医学部附属病院, 主任臨床検査技師 (30721435)
• 研究期間 (年度): 2020-04-01 – 2023-03-31
• キーワード: von Willebrand facor / GPIb / VEGF / Heparin / 血管新生

研究実績の概要

フォン・ウィルブランド因子 (VWF)のヘパリン結合ドメインは成長因子(Growth factor: GF)に結合し、創傷治癒において血管新生を促進する。近年、GFの結合による治癒において血漿および内皮細胞から放出されるVWFがヘパリンへの結合様式のもと血管外マトリックスへ結合することにより、血管新生を調節することが示されている。そのため、止血以外のVWFの重要な機能である可能性がある。本研究ではVWFのヘパリン結合部位のVWFの血管新生機能における重要性を検討、続いて当グループが新たに同定した「血管新生抑制型VEGF-Aアイソフォーム(VEGF-A165b)」がどのような影響を持つのかを検討する。
ECFCの作製
同意を得て分離したVWD type 1、type 2A、type 3 各typeの患者単核球からBOECs（以後ECFCと改称）を樹立した。
対象例：・健常・type2A(GroupⅠ): L1503R・type3(Null): E2341X+Y2631X
単核球はVEGF存在下で培養後典型的なcobblestone形態をとるので、PhenotypeをCD31, CD309等の発現にてフローサイトメトリーにて確認、上清中にVEGF-A165-VWF複合体またはVEGF-A165b-VWF複合体が存在するかを免疫沈降と抗ヒトVWF抗体によるWestern blottingにて確認した。患者血漿についても同様に検討してある。ECFCについてはポリクローナルELISA (DAKO A0082とP226を使用)にて、VWFの細胞学的な発現様式をconfocal immunofluorescenceにて観察中である。これと同時にWeibel-Palade小体に局在するVWF、VEGF-A165、VEGF-A165bの共在につき、抗P-selectin, IL-8, CD63抗体とあわせて検討する。観察を行った細胞はLysateを調整し、Western blottingにてVEGF-A165、165b、VWFのプロセシングを確認、初期実験ではLysateにてVWF:Agが確認された。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

PAD患者のVWF血中濃度については順調に進行しているが、VEGF-A165およびVEGF-A165b のヘパリン結合能については、精製VEGF-A165およびVEGF-A165b蛋白の調達にやや遅れが生じている。

今後の研究の推進方策

野生マウス／VWFノックアウトマウスを用いた以下の検討は今回のプロジェクトのポイントであり、今年度は早期にマウス個体数を増加させる。すなわちHBDのアミノ酸をピンポイントで同定する目的でVWFノックアウトマウスに対してhydrodynamic injectionによりヘパリン結合を欠くmutant VWFを発現させる。マウスにwild typeまたはmutant VWF cDNAをコードする発現ベクターpsvVWF1 (Matsushita, T., et al., J Biol Chem, 2000)をhydrodynamic injectionによりマウス肝において強制発現する。PBSに希釈したPlasmid DNA (50mg)溶液はマウス体重の10%となるよう調整する。プラスミドはマウス尾静脈より7秒以内に急速静注することにより肝に一過性に発現される。採血によりヒトVWF蛋白が発現されたことをSandwich ELISAで確認し、検討に用いる。

次年度使用額が生じた理由

研究の遅れのため当初購入予定であった「6-WELL HANGING CELL CULTURE INSERT, 品番MCEP06H48, ￥25,486」が年度内に納期が間に合わなかったため購入できなかった。よって次年度使用額が生じた。次年度同品を購入する予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Myh9 R702C is associated with erythroid abnormality with splenomegaly in mice. (2021)
  • 著者名/発表者名: Kanematsu T, Suzuki N, Tamura S, Suzuki A, Ishikawa Y, Katsumi A, Kiyoi H, Saito H, Kunishima S, Kojima T, Matsushita T.
  • 雑誌名: Nagoya J Med Sci. 巻: 83(1) ページ: 75-86
  • DOI: 10.18999/nagjms.83.1.75
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Essential role of a carboxyl-terminal α-helix motif in the secretion of coagulation factor XI. (2021)
  • 著者名/発表者名: Hayakawa Y, Tamura S, Suzuki N, Odaira K, Tokoro M, Kawashima F, Hayakawa F, Takagi A, Katsumi A, Suzuki A, Okamoto S, Kanematsu T, Matsushita T, Kojima T.
  • 雑誌名: J Thromb Haemost. 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.1111/jth.15242.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Phase I clinical trial of intra-bone marrow cotransplantation of mesenchymal stem cells in cord blood transplantation. (2021)
  • 著者名/発表者名: Goto T, Murata M, Nishida T, Terakura S, Kamoshita S, Ishikawa Y, Ushijima Y, Adachi Y, Suzuki S, Kato K, Hirakawa A, Nishiwaki S, Nishio N, Takahashi Y, Kodera Y, Matsushita T, Kiyoi H.
  • 雑誌名: Stem Cells Transl Med. 巻: 10(4) ページ: 542-553
  • DOI: 10.1002/sctm.20-0381.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Safety and efficacy of percutaneous radiofrequency ablation for hepatocellular carcinoma patients with haemophilia. (2021)
  • 著者名/発表者名: Yamamoto T, Imai N, Yamamoto K, Ito T, Ishizu Y, Honda T, Okamoto S, Kanematsu T, Suzuki N, Matsushita T, Ishigami M, Fujishiro M.
  • 雑誌名: Haemophilia. 巻: 27(1) ページ: 100-107
  • DOI: 10.1111/hae.14220.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Long-term safety and efficacy of emicizumab for up to 5.8 years and patients' perceptions of symptoms and daily life: A phase 1/2 study in patients with severe haemophilia A (2021)
  • 著者名/発表者名: Shima M, Nagao A, Taki M, Matsushita T, Oshida K, Amano K, Nagami S, Okada N, Maisawa S, Nogami K.
  • 雑誌名: Haemophilia. 巻: 27(1) ページ: 81-89
  • DOI: 10.1111/hae.14205.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Impact of variation in reagent combinations for one-stage clotting assay on assay discrepancy in nonsevere haemophilia A (2021)
  • 著者名/発表者名: Suzuki A, Suzuki N, Kanematsu T, Okamoto S, Tamura S, Kikuchi R, Katsumi A, Kiyoi H, Kojima T, Matsushita T.
  • 雑誌名: Int J Lab Hematol. 巻: 43(1) ページ: 131-138
  • DOI: 10.1111/ijlh.13335
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Vascular endothelial growth factor (VEGF)-A and VEGF-A165b are associated with time to remission of granulomatosis with polyangiitis in a nationwide Japanese prospective cohort study (2020)
  • 著者名/発表者名: Kikuchi Ryosuke,et al.
  • 雑誌名: Annals of Clinical Biochemistry: International Journal of Laboratory Medicine 巻: 58 ページ: 86～94
  • DOI: 10.1177/0004563220968371
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] An overview of the pathfinder clinical trials program: Long‐term efficacy and safety of N8‐GP in patients with hemophilia A (2020)
  • 著者名/発表者名: Matsushita Tadashi、Mangles Sarah
  • 雑誌名: Journal of Thrombosis and Haemostasis 巻: Supp;1(Suppl1) ページ: 26-33
  • DOI: 10.1111/jth.14958
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Indoxyl Sulfate-induced Vascular Calcification is mediated through Altered Notch Signaling Pathway in Vascular Smooth Muscle Cells (2020)
  • 著者名/発表者名: Yamaguchi Kazutoshi、Yisireyili Maimaiti、Goto Sumie、Kato Katsuhiro、Cheng Xian Wu、Nakayama Takayuki、Matsushita Tadashi、Niwa Toshimitsu、Murohara Toyoaki、Takeshita Kyosuke
  • 雑誌名: International Journal of Medical Sciences 巻: 17 ページ: 2703～2717
  • DOI: 10.7150/ijms.43184
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] A Japanese multi‐institutional collaborative study of antigen‐positive red blood cell (RBC) transfusions in patients with corresponding RBC antibodies (2020)
  • 著者名/発表者名: Yamada C, Takeshita A, Ohto H, Ishimaru K, Kawabata K, Nomaguchi Y, Haraguchi Y, Abe M, Sobue K, Takenouchi H, Takadate J, Kamimura M, Katai A, Kasai D, Minami Y, Sugimoto T, Michino J, Nagai K, Kumagai M, et al.
  • 雑誌名: Vox Sanguinis 巻: 115 ページ: 456～465
  • DOI: 10.1111/vox.12906
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Aberrant X chromosomal rearrangement through multi‐step template switching during sister chromatid formation in a patient with severe hemophilia A (2020)
  • 著者名/発表者名: Tokoro Mahiru、Tamura Shogo、Suzuki Nobuaki、Kakihara Misaki、Hattori Yuna、Odaira Koya、Suzuki Sachiko、Takagi Akira、Katsumi Akira、Hayakawa Fumihiko、Okamoto Shuichi、Suzuki Atsuo、Kanematsu Takeshi、Matsushita Tadashi、Kojima Tetsuhito
  • 雑誌名: Molecular Genetics & Genomic Medicine 巻: 8 ページ: e1390
  • DOI: 10.1002/mgg3.1390
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] A survey of blood transfusion errors in Aichi Prefecture in Japan: Identifying major lapses threatening the safety of transfusion recipients (2020)
  • 著者名/発表者名: Ri Masaki、Kasai Masanobu、Kohno Akio、Kondo Masaru、Sawa Masashi、Kinoshita Tomohiro、Sugiura Isamu、Miura Yasuo、Yamamoto Kazuhito、Saito Toshiki I.、Ozawa Yukiyasu、Matsushita Tadashi、Kato Hidefumi
  • 雑誌名: Transfusion and Apheresis Science 巻: 59 ページ: 102735～102735
  • DOI: 10.1016/j.transci.2020.102735
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Long‐term safety and sustained efficacy for up to 5 years of treatment with recombinant factor IX Fc fusion protein in subjects with haemophilia B: Results from the B‐YOND extension study (2020)
  • 著者名/発表者名: Pasi K. John、Fischer Kathelijn、Ragni Margaret、Kulkarni Roshni、Ozelo Margareth C.、Mahlangu Johnny、Shapiro Amy、P’Ng Stephanie、Chambost Herv?、Nolan Beatrice、Bennett Carolyn、Matsushita Tadashi、Winding Bent、Fruebis Joachim、Yuan Huixing、Rudin Dan、Oldenburg Johannes
  • 雑誌名: Haemophilia 巻: 26 ページ: e262-e271
  • DOI: 10.1111/hae.14036
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Higher FVIII:C measured by chromogenic substrate assay than by one-stage assay is associated with silent hemophilic arthropathy (2020)
  • 著者名/発表者名: Ogawa Mika、Suzuki Nobuaki、Takahashi Nobunori、Tamura Shogo、Suzuki Atsuo、Suzuki Sachiko、Hattori Yuua、Kakihara Misaki、Kanematsu Takeshi、Kojima Toshihisa、Katsumi Akira、Hayakawa Fumihiko、Kojima Tetsuhito、Ishiguro Naoki、Kiyoi Hitoshi、Matsushita Tadashi
  • 雑誌名: Thrombosis Research 巻: 188 ページ: 103～105
  • DOI: 10.1016/j.thromres.2020.01.003
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] 特集 検査値を読む2020 4章 血栓・止血検査 von Willebrand因子切断酵素(ADAMTS13) (2020)
  • 著者名/発表者名: 鈴木 伸明、松下 正
  • 雑誌名: 内科 巻: 125 ページ: 561～562
  • DOI: 10.15106/j_naika125_561
  • 国際共著
• [雑誌論文] 特集 検査値を読む2020 4章 血栓・止血検査 von Willebrand因子(抗原,活性,マルチマー構造解析を含む) (2020)
  • 著者名/発表者名: 鈴木 伸明、松下 正
  • 雑誌名: 内科 巻: 125 ページ: 559～560
  • DOI: 10.15106/j_naika125_559
  • 国際共著
• [雑誌論文] 特集 検査値を読む2020 4章 血栓・止血検査 第XIII因子 (2020)
  • 著者名/発表者名: 鈴木 伸明、松下 正
  • 雑誌名: 内科 巻: 125 ページ: 557～558
  • DOI: 10.15106/j_naika125_557
  • 国際共著
• [雑誌論文] 特集 検査値を読む2020 4章 血栓・止血検査 第XI因子 (2020)
  • 著者名/発表者名: 鈴木 伸明、松下 正
  • 雑誌名: 内科 巻: 125 ページ: 555～555
  • DOI: 10.15106/j_naika125_555
  • 国際共著
• [雑誌論文] 特集 検査値を読む2020 4章 血栓・止血検査 第Ⅹ因子 (2020)
  • 著者名/発表者名: 鈴木 伸明、松下 正
  • 雑誌名: 内科 巻: 125 ページ: 553～554
  • DOI: 10.15106/j_naika125_553
  • 国際共著
• [雑誌論文] Performance Evaluation of INNOVANCE^? VWF Ac Assay employing recombinant glycoprotein Ib mutant (2020)
  • 著者名/発表者名: Suzuki Atsuo、Suzuki Nobuaki、Kanematsu Takeshi、Okamoto Shuichi、Tamura Shogo、Shinohara Sho、Arai Nobuo、Kikuchi Ryosuke、Ando Yoshitaka、Kojima Tetsuhito、Matsushita Tadashi
  • 雑誌名: Japanese Journal of Thrombosis and Hemostasis 巻: 31 ページ: 409～419
  • DOI: 10.2491/jjsth.31.409
  • 査読あり
• [学会発表] Endothelial colony forming cells(ECFCs)樹立法の標準化への試み (2020)
  • 著者名/発表者名: 岡本 修一, 鈴木 伸明, 兼松 毅, 鈴木 敦夫, 大平 晃也, 所 真昼, 早川 友梨, 田村 彰吾, 早川 文彦, 清井 仁, 小嶋 哲人, 松下 正
  • 学会等名: 第４２回日本血栓止血学会学術集会
• [学会発表] 高齢者における静脈血栓塞栓症発症の症例対照研究 (2020)
  • 著者名/発表者名: 勝見 章, 室谷 健太, 鴨下 園子, 伊藤 美由紀, 田村 彰吾, 鈴木 伸明, 松下 正, 小嶋 哲人
  • 学会等名: 第４２回日本血栓止血学会学術集会
• [学会発表] Template switchingによるF8エクソン15欠損が認められた重症血友病A症例 (2020)
  • 著者名/発表者名: 所 真昼, 田村 彰吾, 鈴木 伸明, 大平 晃也, 河島 史華, 早川 友梨, 早川 文彦, 岡本 修一, 兼松 毅, 勝見 章, 松下 正, 小嶋 哲人
  • 学会等名: 第４２回日本血栓止血学会学術集会
• [学会発表] 特発性血栓症患者のゲノム情報を用いた層別化による病態解明研究 (2020)
  • 著者名/発表者名: 辻 明宏, 和田 英夫, 森下 英理子, 野上 恵嗣, 荻原 義人, 松下 正, 小嶋 哲人, 大郷 剛, 根木 玲子, 小亀 浩市, 安田 聡, 山田 典一, 関根 章博, 宮田 敏行
  • 学会等名: 第４２回日本血栓止血学会学術集会
• [学会発表] 凝固一段法による第VIII因子活性測定における試薬の組み合わせに関する検討 (2020)
  • 著者名/発表者名: 鈴木 敦夫, 鈴木 伸明, 兼松 毅, 岡本 修一, 田村 彰吾, 安藤 善孝, 清井 仁, 松下 正
  • 学会等名: 第４２回日本血栓止血学会学術集会
• [学会発表] C末端伸長変異型Factor XIにおける分泌異常の解析 (2020)
  • 著者名/発表者名: 早川 友梨, 田村 彰吾, 鈴木 伸明, 大平 晃也, 所 真昼, 河島 史華, 早川 文彦, 高木 明, 鈴木 敦夫, 岡本 修一, 兼松 毅, 松下 正, 小嶋 哲人
  • 学会等名: 第４２回日本血栓止血学会学術集会
• [学会発表] スプライシング異常を引き起こす血液凝固第IX因子遺伝子イントロン1内の深部大挿入変異 (2020)
  • 著者名/発表者名: 河島 史華, 田村 彰吾, 鈴木 伸明, 大平 晃也, 所 真昼, 早川 友梨, 早川 文彦, 岡本 修一, 兼松 毅, 高木 明, 松下 正, 小嶋 哲人
  • 学会等名: 第４２回日本血栓止血学会学術集会
• [学会発表] Real-World Effectiveness Evaluation of the Recombinant Factor VIII Fc Fusion Protein in Adolescents and Children with Hemophilia A in Japan: "Fc Adolescent and Children Treatment" Study (FACTs) Part 1 Interim Analysis (2020)
  • 著者名/発表者名: M. Kobayashi, T. Matsushita, K. Nogami, I. Usami, M. Shiraishi, M. Takatok
  • 学会等名: ISTH 2020 Congress
  • 国際学会
• [学会発表] Low-factor consumption and cost effectiveness for surgeries in hemophilia B patients with N9-GP (2020)
  • 著者名/発表者名: 岡本修一 松下正 兼松毅 鈴木敦夫 田村彰吾 小嶋哲人 鈴木伸明
  • 学会等名: ISTH 2020 Congress
  • 国際学会
• [学会発表] Investigation of a significant factor to improve an establishment of endothelial colony forming cell (2020)
  • 著者名/発表者名: 岡本修一 鈴木伸明 兼松毅 鈴木敦夫 大平晃也 所真昼 早川友梨 田村彰吾 早川文彦 清井仁 小嶋哲人 松下正
  • 学会等名: ISTH 2020 Congress
  • 国際学会
• [学会発表] Molecular pathology of VWF G2752S mutation identified in a VWD patient with severe VWF defect (2020)
  • 著者名/発表者名: Shuichi Okamoto ，Koya Odaira ，Yuri Hayakawa ，Fumika Kawashima ，Shogo Tamura ，Nobuaki Suzuki ，Takeshi Kanematsu ，Atsuo Suzuki ，Fumihiko Hayakawa ,Hitoshi Kiyoi ，Tetsuhito Kojima ，Tadashi Matsushita
  • 学会等名: 第82回血液学会学術集会
• [学会発表] A critical role of carboxyl-terminal α-helix in secretion of coagulation factor XI (2020)
  • 著者名/発表者名: Yuri Hayakawa ，Shogo Tamura ，Nobuaki Suzuki ，Koya Odaira ，Mahiru Tokoro ，Fumika Kawashima ，Fumihiko Hayakawa ，Atsuo Suzuki ，Shuichi Okamoto ，Takeshi Kanematsu ，Akira Katsumi ，Tadashi Matsushita ，Tetsuhito Kojima
  • 学会等名: 第82回血液学会学術集会
• [学会発表] フォンヴィレブランド病の病態と治療、臨床試験データについて (2020)
  • 著者名/発表者名: Tadashi Matsushita
  • 学会等名: Takeda von Willebrand disease online in June(武田薬品工業)web
  • 招待講演
• [学会発表] von Wellebrand因子とvon Willebrand病 (2020)
  • 著者名/発表者名: Tadashi Matsushita
  • 学会等名: Takeda von Wellebrand disease symposium
  • 招待講演
• [学会発表] von Wellebrand因子とvon Willebrand病 (2020)
  • 著者名/発表者名: Tadashi Matsushita
  • 学会等名: 第16回埼玉血友病地域連携ネットワーク・オンライン
  • 招待講演
• [産業財産権] 血液検体の分析方法、分析装置及びコンピュータプログラム (2020)
  • 発明者名: 鈴木敦夫、松下正、篠原翔、新井信夫
  • 権利者名: 名古屋大学
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: C20170396US#P01
  • 外国