| 研究課題/領域番号 |
20K08736
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| 研究機関 | 鹿児島大学 |
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研究代表者 |
吉満 誠 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 准教授 (70404530)
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| 研究分担者 |
石塚 賢治 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 教授 (10441742)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | CARD11 / 結晶構造解析 / 成人T細胞白血病リンパ腫 |
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| 研究実績の概要 |
CARD11 PROTAC作製のため、CARD11の結晶構造を明らかにするために、創薬等先端技術支援基盤プラットフォーム（BINDS）の支援を受け、『CARD11を標的とした
新規化合物同定を目指したX線結晶構造解析（課題番号【1006】）』の課題のもとCARD11（CARMA1）のX線結晶構造解析を進めている。CARD11のSH3-GUKドメイン
の部分結晶構造化について、結晶化条件の検討を行っている。さらにSH3ドメインのみの結晶化についても並行して行ってきた。昆虫細胞にHis-tag-CARD11発現ウイルスを使ってトランスダクション3日間培養、バッファーの至適pHの確認し超音波で細胞破砕を行った。Ni-NTA樹脂にHisタグタンパクを結合、目的タンパクの抽出し酵素を使用し目的タンパク質からHisタグを除去後ゲル濾過クロマトグラフィーにより精製した。キャピラリー電気泳動で確認しイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。単一のピークがえられず、またイオン交換クロマトグラフィー後検体を用いたキャピラリー電気泳動でも複数のバンドを認めた。純粋な単一サンプルではないと考えられ、N末端アミノ酸配列を確認したところ、SH3-GUKドメインのSH3とGUKの間にあるR↓ALRNTLで切断していることが判明した。その切断点は各種哺乳類で保存されていた。今後はその切断点に変異を挿入し結晶化条件の検討を行う予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本研究の遂行にあたり、CARD11の結晶構造決定を行っているが、昆虫系細胞発現系では標的ドメインに切断点が入ることから結晶条件の検討にすすめていないため。
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| 今後の研究の推進方策 |
Alphafold2による構造予測を試みたところ、これまでSH3-GUKドメインと予想された部位の別の部位もSH3-GUKドメインを構成することが予想されたため、その部分も組み入れた発現プラスミドの構築予定である。
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