| 研究課題/領域番号 |
20K08742
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| 研究機関 | 関西医科大学 |
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研究代表者 |
松岡 由和 関西医科大学, 医学部, 助教 (70533420)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | CD34抗原 / 造血幹細胞 / 分化能 |
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| 研究実績の概要 |
本年度においては、最初にCRISPR/Cas9を用いたヒト造血幹細胞からのCD34抗原のノックアウトの効率化を行った。造血幹細胞へのCRISPR/Cas9の導入は、Cas9タンパク質とguide RNAによるRibonucleoprotein複合体を形成させた後、electroporationにより導入する方法が効率が良いことが知られているため、本研究においても同手法を用いた。しかしながら、本研究で扱う造血幹細胞はその希少性から多数の細胞を用意することが困難である。また、ヒト各臍帯血より得られる造血幹細胞の数は、検体間で大きな差がある。そのため、実験群間で扱う細胞数が異なり溶媒中の細胞密度に違いが生じるため、electroporationにより安定してCRISPR/Cas9を導入することが難しい。そこで、造血幹細胞へのelectroporationによるCRISPR/Cas9導入時に、carrierとして過剰量の間質細胞を混ぜることで、安定した結果が得られることを見出した。この手法を用いて、ヒト造血幹細胞よりCD34抗原をノックアウトした細胞と、研究代表者が独自に樹立したヒト骨髄由来間質細胞と共培養を行った。1週間の共培養後に細胞を回収し、蛍光標識された抗体と反応させた後、各細胞の分化能をフローサイトメトリーにより評価した。その結果、CD34抗原をノックアウトした細胞は対照群である正常の造血幹細胞と比較しても、その単球/マクロファージ、顆粒球系細胞、赤芽球、巨核球、NK細胞への分化能に有意な差は認められなかった。また、すでに実施済みのコロニーアッセイ法においても、CD34抗原ノックアウトによるコロニー形成能への影響は認められなかったことから、in vitroにおいてCD34抗原が造血幹細胞の分化に与える影響は小さいものであることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究遂行上、技術的な問題等は発生しておらず、予定通り進めることができている。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度に開発した、造血幹細胞へのCRISPR/Cas9導入法により、効率的に実験を進めることが可能となった。今後、この手法を用いて造血幹細胞よりCD34抗原をノックアウトした細胞を用いることで、in vivoにおける造血幹細胞特性の評価および遺伝子発現解析を進める予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
コロナウィルスの影響により動物実験の縮小を行っているため、年度末に購入予定であった重症免疫不全マウスの購入を延期した。そのため、およそ600千円を次年度マウス購入費として留保した。
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