| 研究課題/領域番号 |
20K08760
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| 研究機関 | 奈良県立医科大学 |
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研究代表者 |
武山 雅博 奈良県立医科大学, 医学部, 講師 (30572010)
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| 研究分担者 |
野上 恵嗣 奈良県立医科大学, 医学部, 准教授 (50326328)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 第VIII因子 / 活性化プロテインC |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、FVIIIを中心とした凝固・抗凝固機能のさらなる解明と、抗凝固機能を受けにくい変異FVIIIを作成することにより、安定型・長時間作用型FVIII製剤へ応用することである。我々が目指す新規FVIII製剤は、APC/PSの結合部位を変異させた全く新たな機序による製剤である。新規FVIII製剤はAPC/PSとの結合能が弱く、APC/PSにより不活化されにくいため、従来のFVIII製剤より安定性が高く、長時間作用すると考えられる。これまでに、FVIII上のAPC結合部位の詳細な同定を行い、APCがFVIII軽鎖（A3ドメイン）アミノ酸残基2007-2016に結合することを示した。これらの研究をもとに、当該年ではFVIII重鎖（A2ドメイン）上の新規APC結合部位の同定について研究を行った。まず、不活化(DEGR-)APCとFVIII A2ドメインの結合をBiacoreにより確認し、そのKdはおよそ40nMであった。これまでの検討で、FVIII A2ドメイン上のAPC結合部位はアミノ酸残基400-429内にあることが想定されているため、アミノ酸残基400-409, 409-419, 420-429の合成ペプチドを作成した。プラスモン共鳴法により、DEGR-APCと各ペプチドが結合するかを検討した。その結果、ペプチド420-429のみがDEGR-APCと結合し、同領域がAPCの結合部位であることが示唆された。FVIIIはAPCにより開裂を受け、不活化されるが、その不活化が本ペプチドの存在により阻害されるかを検討した。本ペプチド存在下ではFVIIIのAPCによる不活化は、本ペプチド非存在下と比べて低下しており、本ペプチドがAPCの作用を阻害することを示した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
研究に用いるFVIIIはベビーハムスター腎臓細胞（BHK）で発現させ、精製しているが、FVIIIの発現が極めて悪くなり、その原因の究明および対策に時間を要したため、研究が遅延した。
現在、FVIIIの発現は順調に行えるようになったため、今後研究を進めていく。
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| 今後の研究の推進方策 |
当該年の研究により、FVIII A2ドメインのアミノ酸残基420-429にAPCの新規結合部位がある可能性が示された。今後、APCと420-429ペプチドが、EDCクロスリンカーにより結合するかをWestern blottingを用いて検討する。さらに、western blottingによりAPCと420-429ペプチドをEDCクロスリンカーさせたbandを、アミノ酸シークエンスすることで、APCと結合するアミノ酸残基の同定をすすめる。APCと結合するアミノ酸残基が同定されれば、該当アミノ酸をアラニン等に変異させた変異FVIIIを作成し、解析を進める予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当該年度はFVIIIの生成がうまくいかなかった時期があったため、当初計画より消耗品が少なかったため、次年度使用額が生じた。次年度に、翌年度の助成金と合わせて消耗品購入のために使用する予定である。
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