| 研究課題/領域番号 |
20K08764
|
|---|
| 研究機関 | 防衛医科大学校(医学教育部医学科進学課程及び専門課程、動物実験施設、共同利用研究施設、病院並びに防衛 |
|---|
研究代表者 |
大澤 有紀子 防衛医科大学校(医学教育部医学科進学課程及び専門課程、動物実験施設、共同利用研究施設、病院並びに防衛, 内科学, 助教 (00816928)
|
|---|
| 研究分担者 |
木村 文彦 防衛医科大学校(医学教育部医学科進学課程及び専門課程、動物実験施設、共同利用研究施設、病院並びに防衛, 内科学, 教授 (50536216)
小林 真一 防衛医科大学校(医学教育部医学科進学課程及び専門課程、動物実験施設、共同利用研究施設、病院並びに防衛, 内科学, 講師 (50724655)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
|
| キーワード | 骨髄線維症 / 線維化解除 |
|---|
| 研究実績の概要 |
原発性骨髄線維症は骨髄の線維化と髄外造血を特徴とする造血器悪性腫瘍で、確立している根治療法は同種造血幹細胞移植のみである。移植を行うと骨髄の線維化は徐々に消失して解除されることから、線維化を構成している膠原線維に対して何らかの分解機序が働いていると考えられる。
我々は、トロンボポエチン受容体作動薬であるロミプロスチムを投与することで、骨髄の線維化を誘導するマウスモデルを作成した（Leukemia 2017;31:2709）。このマウスではロミプロスチムの追加投与を中止すると、線維化が解除される現象を認めている。この現象は膠原線維の分解機序を解明するモデルになると考え、詳細な分子機序を検討することにした。
骨髄の線維化解除の時間経過を明らかにするため、C57BL/6マウスを一群３匹としてロミプロスチム（1mg/kg）を２回（1日目, 8日目）投与後、9日目、11日目、13日目、15日目、18日目、21日目に大腿骨、脾臓、末梢血を採取した。大腿骨は組織標本を作製し、HE染色、鍍銀染色、マッソントリクローム染色で評価を行った。脾臓は重量を測定し、血液は血算測定と血清保存を行った。また遺伝子解析を行うために各検体の一部は凍結保存した。
骨髄線維化のピークは11日目から13日目にかけて出現した。11日目に巨核球数と白血球数、遅れて13日目に脾臓の重量がピークを迎えた。18日目になると白血球数はほぼ正常値に戻ったが、脾臓の重量はロミプロスチム２回投与直後の重量にとどまった。骨髄線維化は18日目にはほぼ消失した。9日目から21日目を通して赤血球数、ヘモグロビン量、ヘマトクリット値はわずかな減少傾向を認めたが、ほぼ正常値の範囲内であった。血小板は測定期間を通して高値を示し測定不能だった。以上より、この系では線維化解除の分子機序は線維化のピーク前後から18日目にかけて活性化されていると考えられた。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
本研究では骨髄線維化に関わる酵素や細胞を検討し、線維化の解除に関わる分子標的を探索することを目的とし、生体内の現象をとらえるために動物レベルで実験を遂行することを前提にしている。解析に使用するマウスモデルでは医薬品であるロミプロスチムの投与で骨髄の線維化を誘導している。従前、ロミプロスチムは国内生産品を使用していたが、適応疾患の拡大によって国内需要が増加したため2020年６月から出荷調整がはじまり、基礎研究用としての入手が不可能となった。海外製品が入手できるまでの約半年間は実験を遂行することができなくなり、再開後に行った実験動物への投与スケジュールと組織標本作製期間から、実績概要に示した結果にとどまった。
|
| 今後の研究の推進方策 |
①骨髄線維化レベルの数値化
組織標本の画像を数値化するために、連結画像による全体像を対象として、線維化部位の面積、膠原線維の形状等を定量化する。これにより線維化の進展度が客観的に評価でき、線維化解除の時間経過をより厳密に評価することが可能になる。
②骨髄線維化解除に関与する細胞や酵素の探索
骨髄線維化の消長は膠原線維の合成と分解のバランス変化を反映していると考えられ、膠原線維を分解するマトリックスメタプロテアーゼ（MMP）に着目した予備実験では、Ⅰ型及びⅢ型コラーゲンを分解するMMP-8、Ⅳ型及びⅤ型コラーゲンを分解するMMP-2とMMP-9の上昇を観察している。すでに収集したサンプルを用い、線維化解除の時間経過に合わせてこれらの分子の発現変化をRQ-PCR、免疫組織染色で検討する。さらにMMP産生が最大となる時期を選択し、他の細胞マーカーを用いて免疫組織染色法でMMP産生細胞を同定する。またフローサイトメトリーでMMP産生細胞の同定を確認する。マウスモデルではMMP阻害薬を投与して線維化解除の遅延が認められるかどうかについて検討を加える。またMMP-8の産生抑制に働くメタプロテアーゼ阻害剤-３（TIMP-3）タンパク質の変化も評価したい。
③線維化解除機序の促進方法の探索
G-CSFは好中球のMMP-8及びMMP-9産生能を増加させることをふまえ、モデルマウスにG-CSFを投与して線維化解除の促進効果を検討する。同様に骨髄線維症患者の末梢血好中球を培養し、MMP-8、MMP-9、TIMP-3の産生能、G-CSF曝露の産生に与える影響を調べる。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
今まで使用していたロミプロスチムの国内生産品が入手不可能になり、海外製品を入手できるまでは実験を遂行できなかったため、マウスの使用頭数や組織標本の作製数が少なかった。またELISAキットやフローサイトメトリー用蛍光抗体の購入がなかったため、次年度使用額が生じた。
次年度は線維化解除に関与する細胞や酵素を探索するために、各種MMPやTIMP-3のELISAキット及び免疫組織染色用抗体を購入する。阻害薬投与による線維化解除遅延を検討するために、MMP阻害剤となる合成ペプチドや低分子化合物を購入する。
|
