| 研究課題/領域番号 |
20K08782
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| 研究機関 | 帝京平成大学 |
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研究代表者 |
秋山 晴代 帝京平成大学, 薬学部, 准教授 (50420229)
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| 研究分担者 |
栗坂 知里 帝京平成大学, 薬学部, 助教 (00846785)
中村 亮介 国立医薬品食品衛生研究所, 医薬安全科学部, 室長 (50333357)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | EXiLE法 / 架橋 / FcεRI / セルフリー |
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| 研究実績の概要 |
アレルギー試験法EXiLE法は、ヒトの高親和性IgE受容体(FcεRI)を発現させた培養マスト細胞株を、アレルギー患者血清(IgE)で感作し、抗原添加による細胞の活性化をルシフェラーゼアッセイにより検出する手法で、高感度にIgEの「架橋活性」を評価できる画期的な試験法である。しかし一方で、本法では一部の血清や抗原が細胞障害性を示し正確な測定が出来ない問題に直面している。そこで本研究では、EXiLE法の特徴を活かし、「架橋」を指標とした新しい「セルフリー型」アレルギー試験法の開発を主目的とする。具体的には、ルシフェラーゼ相補性システムを利用して各種発光タグ融合FcεRI α鎖を作製し、セルフリー条件下IgEと抗原結合により導かれるFcεRIの架橋を評価する新しいアレルギー試験系を開発する。
昨年度は、Fragment Complementation AssayのレポーターとしてNanoBit、リコンビナントFcεRI α精製用のタグとしてはHaloTag(HT)を用いることとし、4通りのFcεRI α－レポーター配列を作製した。令和3年度は、T7プロモーターを有しているHT用ベクターのN末端側とC末端側に作製した配列(4通り)を挿入した遺伝子を作製した。作製した遺伝子を、T7 RNA大腸菌プロテアーゼ等を含む大腸菌抽出液、アミノ酸、rNTP、tRNA抽出液等を含むPremix液と37℃、1時間の条件で反応させ、タンパク質の誘導を行い、Haloレジンを用いて精製を試みた。次年度は、無細胞系タンパク質合成の誘導条件の検討を行い、収量、純度の高いリコンビナントタンパク質の精製を試みると共に、セルフリー条件下IgEと抗原結合によるFcεRIの架橋を評価可能かどうか検討する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
昨年度に続き新型コロナウイルス感染症の影響により消耗品が入手困難であったこと、さらにコロナ禍の対応により研究時間が大幅に減少したことにより、当初の予定どおりに検討が進まなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度は、4通りの遺伝子について、無細胞タンパク質合成システムを用いたリコンビナントタンパク質の収量をあげるために条件検討を行う。さらに。レポーター付加FcεRI αを精製し、新規アレルギー試験系の構築を目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
昨年度に続き新型コロナウイルス感染症の影響により消耗品が入手困難であったこと、さらにコロナ禍の対応により研究時間が大幅に減少したことにより、当初の予定どおりに検討が進まなかったため。次年度は「今後の研究の推進方策」に沿って計画を進め、研究費を活用していく。
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