| 研究課題/領域番号 |
20K08782
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| 研究機関 | 帝京平成大学 |
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研究代表者 |
秋山 晴代 帝京平成大学, 薬学部, 准教授 (50420229)
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| 研究分担者 |
栗坂 知里 帝京平成大学, 薬学部, 助教 (00846785)
中村 亮介 国立医薬品食品衛生研究所, 医薬安全科学部, 室長 (50333357)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | EXiLE法 / 架橋 / FcεRI / セルフリー |
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| 研究実績の概要 |
アレルギー試験法EXiLE法は、ヒトの高親和性IgE受容体(FcεRI)を発現させた培養マスト細胞株を、アレルギー患者血清(IgE)で感作し、抗原添加による細胞の活性化をルシフェラーゼアッセイにより検出する手法で、高感度にIgEの「架橋活性」を評価できる画期的な試験法である。しかし一方で、本法では一部の血清や抗原が細胞障害性を示し正確な測定が出来ない問題に直面している。そこで本研究では、EXiLE法の特徴を活かし、「架橋」を指標とした新しい「セルフリー型」アレルギー試験法の開発を主目的とする。具体的には、ルシフェラーゼ相補性システムを利用して各種発光タグ融合FcεRI α鎖を作製し、セルフリー条件下IgEと抗原結合により導かれるFcεRIの架橋を評価する新しいアレルギー試験系を開発する。
昨年度は無細胞系およびPEIを用いたHEK293T細胞へのトランスフェクションを試みたが、目的タンパク質の発現は確認できなかった。そこで本年度は目的タンパク質の発現量を増加させるため、昨年度HaloTag(HT)用ベクターを用いて作製したFcεRI α－レポーター(NanoBit)配列を挿入した遺伝子の5’末端にプレプロトリプシンのリーダー配列を付加したベクターを新たに作製し、分泌型で目的タンパク質を発現させた。PEIを用いてHEK293T細胞へのトランスフェクション後、培養上清を回収し、Haloレジンを用いて目的タンパク質を精製した。CBB染色および抗FcεRIα抗体を用いたウエスタンブロットにより、目的タンパク質の発現を認めた。今後は、今回精製した2種の発光タグ融合FcεRIα鎖を用いてIgEと抗原結合の架橋を評価するための感作時間、抗原との反応時間などの条件検討を実施する予定である。
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