| 研究課題/領域番号 |
20K08805
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| 研究機関 | 埼玉医科大学 |
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研究代表者 |
梶山 浩 埼玉医科大学, 医学部, 講師 (90328386)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | ヒドロキシクロロキン / ポドサイト / 細胞死 / 保護効果 |
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| 研究実績の概要 |
ヒドロキシクロロキン(HCQ)は全身性エリテマトーデス患者の生命予後、腎機能予後を改善し、再燃を抑制する重要な免疫調整薬であるが、その網膜毒性により、およそ7~8%の症例でHCQ網膜症を惹起する。稀ではあるが、最近、HCQの腎毒性の報告もある。従って、本研究では、腎臓の糸球体で尿への高分子蛋白の漏出を抑える分子篩として機能する、臓側糸球体上皮細胞(ポドサイト)の細胞株を用いて、HCQのポドサイトへの保護効果と細胞毒性を検討することを目的とした。
保護効果の確認の為、マウス培養ポドサイトに、10microg/mL未満の低濃度のHCQを加えて14日間長期培養し形態を観察した。HCQを加えていないコントロールに比べて、低濃度HCQで処理したマウス培養ポドサイトにおいてより細胞死は抑制された。
一方、0.009microg/mLから40microg/mLlの濃度のHCQを加えて培養したマウス培養ポドサイトにおいては、HCQを加えて2日後には10~40microg/mLの濃度では、細胞死を誘導したが、10microg/mL未満のHCQでは、細胞死を誘導しなかった。
加えるHCQの濃度が高くなると、その細胞内の顆粒と空胞形成が増えて、ポドサイトは細胞死に至ることが、経時的な形態の観察から予測される。HCQはライソゾーム系やオートファジーに影響を与えることが既報で明らかになっている事から、ライソゾーム・オートファジー系に関わる複数のキナーゼ阻害剤を用いて、HCQによる細胞死を抑制できるか検討したところ、一部のキナーゼ阻害剤でHCQによる細胞死を抑制できることが明らかになった。また、リソゾーム形成に関わる転写因子TFEBの免疫蛍光染色を施行したところ、TFEBは高濃度HCQを加える前から核内へ分布しており、定常状態である程度、リソゾーム形成に関する経路が活性化していることが考えられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
C02インキュベーターの機能異常で細胞培養実験が不可能であった時期があり、遅れの一因となった。
低濃度のHCQによるポドサイトの保護効果については、マウスおよびヒトの培養ポドサイトにおいて、再現性よく確認できたが、まだ分子機序まで踏み込んだ検討はできていない。また、高濃度HCQのポドサイトへの細胞毒性の機序について、その細胞死に関与するキナーゼを、ある程度、絞り込めてはいるが、一方で、高濃度HCQの添加で出現する、細胞内の顆粒、空胞の形成の亢進について、ポドサイト分化マーカーや、オートファジーマーカーの発現、ライソゾーム形成に関わる転写因子TFEB、TFE3の発現の確認が不十分であり、やや遅れていると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、高濃度HCQによる培養ポドサイト細胞死の機序について、ポドサイトマーカーの発現の変化、転写因子TFEB、TF3Bの核内分布の程度と発現の変化、オートファジーマーカーの発現の変化などについて、免疫蛍光法、ウェスタンブロッテイング法どで検討する。
また、ライソゾーム・オートファジーに関与するキナーゼについて、複数のキナーゼの中からどのキナーゼ活性が最も影響が強いかを、siRNA、免疫蛍光法、ウエスタンブロッテイングで検討する。今年度後半には、RNAsq解析を行い、網羅的に高濃度HCQ処理によるポドサイト細胞死に重要なpathwayを明らかにしたい。
上記のキナーゼの検討、RNAsq解析の結果をもとに、来年の最終年度までに、実際のHCQ内服症例の血清と尿検体を用いて、実際の症例で、HCQによる網膜傷害や腎傷害と関連のあるバイオマーカーを見出す臨床研究に入る予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
前述の通り、細胞培養器の機能障害により、一時実験が施行できなかったこと、また、まだ昨年度、データが不十分だった部分について、実験が遅れている。次年度使用額は、ポドサイトマーカーや、オートファジーマーカー、及び、リソゾーム・オートファジーに関わる転写因子TFEB, TFE3の培養ポドサイト内での分布、発現の程度について、蛍光抗体法、ウエスタンブロッテイングにて検討していく費用として、21年度の前半で使用予定である。
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