| 研究課題/領域番号 |
20K08823
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| 研究機関 | 熊本大学 |
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研究代表者 |
津々木 博康 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 助教 (40586608)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 細菌毒素 / 腸管出血性大腸菌 / レドックス / 小胞体ストレス |
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| 研究実績の概要 |
Subtilase cytotoxin (SubAB)は、腸管出血性大腸菌（enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC）O113:H21株から新規の毒素として同定された。わが国でも重症患者からSubABを産生するEHECが分離されており、新たな病原因子として重要視されているが、感染病態におけるSubABの病原性は不明である。SubABは宿主細胞に侵入すると小胞体（ER）に移行する。Aサブユニットはセリンプロテアーゼ活性をもち、ERのシャペロン蛋白質BiPを切断することで宿主細胞にERストレス性の細胞死を誘導する。
これまでの解析からSubABの毒性の発現にレドックス調節（S-S結合の還元など）による活性化が分かってきた。そこでSubABの毒性発現に関与する宿主レドックス調節蛋白質の探索を行い、ジスルフィド結合の転移酵素であるProtein disulfide isomerase （PDI）がSubABを活性化し、BiPの切断を誘導する宿主レドックス調節分子であることを報告した（Tsutsuki H. et al, 2020）。遺伝子ノックダウンや阻害剤を用いた実験から、さらに他にも宿主レドックス調節蛋白質の候補を見出した。CRISPR-cas9システムを用いて遺伝子欠損（KO）細胞を樹立し解析を行ったところ、SubABの病原性発現に関与することが確認された。一方、一酸化窒素がSubABによるBiPの切断を減弱することを見出した。一酸化窒素は今回同定した宿主蛋白質を阻害することでSubABの毒性発現を抑えていることが示唆された。また、SubABは宿主感染防御機構であるインフラマソームとそれによるインターロイキンの産生を抑制し、腸管病原性細菌の感染が増悪化することを報告した（Tsutsuki H. et al,2022）。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
候補タンパク質の遺伝子欠損(KO)細胞の樹立や阻害剤の探索に時間を要した。また、同定した候補タンパク質が酵素であったため、組換えタンパク質を用いた活性測定法を樹立したが、その変異体作製に時間を要したことでやや遅れていると判断した。現在組換えタンパク質を発現する細胞を作製し、さらに詳細な解析を目指している。
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| 今後の研究の推進方策 |
候補タンパク質のKO細胞をすでに樹立して解析法を樹立している。現在、組換えタンパク質をそのKO細胞に発現させるために発現プラスミドを構築中である。特に、システインをセリンに置換した組換えタンパク質を発現する細胞を作製し、これと比較することでさらに詳細な解析を行う予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当該年度に購入を予定していた試薬、ディスポーザブルプラスチック製品の納期が年度内に間に合わなくなったため未使用額が生じた。また、新型コロナウイルス感染症の発生状況により多くの学会がオンライン発表となり、当初予定していた旅費を物品購入に使用する必要が生じた。当該年度に購入できなかった試薬などの物品は次年度に購入予定である。年度末に論文が受理され、論文掲載料を当該年度に支払う予定であったが、出版社からの請求書（Invoice）が間に合わなかった。論文掲載料については次年度の支払いとなった。
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