| 研究課題/領域番号 |
20K08867
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| 研究機関 | 奈良県立医科大学 |
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研究代表者 |
秦野 修 奈良県立医科大学, 医学部, 講師 (40164850)
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| 研究分担者 |
竹田 浩之 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 准教授 (40609393)
竹森 洋 岐阜大学, 工学部, 教授 (90273672)
大西 健 茨城県立医療大学, 保健医療学部, 教授 (50152195)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | Salt-Inducible Kinases / ステロイドホルモン産生 / 標的プロテオミクス / AlphaScreen 法 / コムギ胚芽無細胞タンパク質合成 |
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| 研究実績の概要 |
塩誘導キナーゼ（SIK1,2,3)はAMPKファミリーに属し、SIK1,2,3 の各欠損マウスはステロイド合成酵素群の発現異常、生殖異常、代謝異常、軟骨形成異常、虚血性疾患などの多彩で重篤な異常を呈する。これら多様な表現型異常に関与する SIK1,2,3 の機能発現機序を解析する目的で、SIK1,2,3 に結合するタンパク質を、ヒト転写因子群、シグナル伝達関連分子群等から網羅的な探索を行った。この際、SIK1,2,3 のキナーゼドメインと全長タンパク質とを区別して結合タンパク質の探索を行なうこととし、本研究では、SIK1,2,3 の全長タンパク質をコムギ胚芽無細胞系で合成すると共に、それらのビオチン化を行った後、Western Blot法で各々のタンパク質の合成を確認した。次に、愛媛大学プロテオサイエンスセンターが構築した約8300種のヒトタンパク質アレイ（転写因子等のDNA結合タンパク質：約1300種、プロテインキナーゼ群：約500種、epigenetic 関連因子：約800種、GPCRs：約700種、他を含む）から AlphaScreen 法を用いて、SIK1,2,3 全長タンパク質各種との結合実験を網羅的に行ない、SIK1,2,3 全長タンパク質各種に強く結合するヒトタンパク質を、各々約20種同定した。
又、同定タンパク質のステロイド産生組織における組織立体構造上での機能分布を明らかにする目的で、近年、数多く開発されている種々の組織透明化手法の有効性を検討している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ヒト SIK1,2,3 に結合し、シグナル伝達や転写関連因子等のSIK機能発現に関与するヒトタンパク質を同定するために、ビオチン化ヒト SIK1,2,3 の各全長タンパク質と、プロテインキナーゼ群、転写因子群等をほぼ網羅的に含む約8300種のヒトタンパク質アレイから、AlphaScreen 法を用いて結合タンパク質の網羅的探索を行い、SIK1,2,3 全長タンパク質の各種に対して、強く結合するヒトタンパク質を各々約20種同定できたから。
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| 今後の研究の推進方策 |
ヒト SIK1,2,3 の全長タンパク質と相互作用するタンパク質を、約8300種からなるヒトプロテインアレイ(プロテインキナーゼ群、転写関連因子群等をほぼ網羅的に含む)からスクリーニングしたところ、SIK1,2,3 各種の全長タンパク質に強く結合するヒトタンパク質を各々20種程度ずつ同定できたが、SIK1,2,3 間で、結合タンパク質の種類に大きな違いは認められなかった。SIK1,2,3 の各欠損マウスは、それぞれに特徴的な異なる表現系異常を呈することから、今後、各SIK種に特異的な異なる結合タンパク質の同定が望まれ、そのためには培養細胞などのよりin vivo に近い状態でのSIK結合タンパク質の同定が必要と考えられる。そこで、培養細胞に導入して結合タンパク質を同定可能な近位依存性ビオチン化酵素(最近開発された AirID）等を用いて、培養細胞内における機能に関連した SIK1,2,3 の結合タンパク質の同定を行っていきたい。これにより、各SIKキナーゼの各々に特異的な機能発現機構を明らかにすると共に、ステロイドホルモン産生機構との関連を明らかにしていきたい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
2021年度中に全額を使い切るのでなく、次年度の予算と共により有効に研究費を活用するために、次年度使用額が生じた。次年度使用額は消耗品に使用する。
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