糖尿病性虚血性疾患に対する体性幹細胞由来分泌因子を用いた治療法の開発

2020 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 20K08874
• 研究機関: 愛知医科大学
• 研究代表者: 神谷 英紀 愛知医科大学, 医学部, 教授 (70542679)
• 研究分担者: 恒川 新 愛知医科大学, 医学部, 准教授 (40612768)
• 研究期間 (年度): 2020-04-01 – 2023-03-31
• キーワード: 血管新生 / ヒト乳歯歯髄幹細胞 / ヒト臍帯静脈内皮細胞

研究実績の概要

糖尿病は心血管疾患および重症下肢虚血などの虚血性疾患の重要な危険因子である。近年，虚血性疾患の新たな治療法として再生医療が期待されている。我々は以前に，ヒト乳歯歯髄幹細胞（SHED）培養上清（SHED-CM）による神経修復効果を報告した。その要因としては，SHEDからの分泌因子群による末梢神経栄養血管の血流改善および血管新生の促進が一因であることが示唆されているが，SHED培養上清が血管新生を促進する詳細なメカニズムは未だに明らかでない。今回，SHEDからの分泌因子が血管内皮細胞へ及ぼす直接的な効果を検討した。
MTT assayにおいて，SHED-CMはヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVECs）のviabilityを有意に増加させ、また血管内皮細胞遊走能を有意に促進した。Tube formation assayにおいて，SHED-CMによるHUVECsの管腔形成の有意な促進が認められた。血管新生の一連の過程を包括的に評価するAortic ring assayにおいて，SHED-CMの添加によってラット大動脈輪からの新生血管長の有意な伸長を認め，SHED-CMの血管新生促進効果が確認された。いずれのassayにおいても，6 kDa以上の分画はwhole SHED-CMと同等かそれ以上の効果を示した。MTT assayおよびTube formation assayにおいてエクソソームは統計学的には有意な促進効果を示したが，SHED-CMと比較してその効果は小さく，エクソソームが血管新生に及ぼす影響はごく僅かと考えられた。
SHED-CMは血管内皮細胞を直接刺激して血管新生の全ての過程を促進することが示唆され，虚血性疾患に対し今後の臨床応用が期待される治療リソースと考えられた。

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

研究は、上記の研究実績概要に示した通り順調に進んでいると考えます。

今後の研究の推進方策

オミックス解析を用いて詳細な分子作用機序の解明を進める。解明しえた有効分泌因子を糖尿病モデル動物へ筋肉内投与し、その効果を細胞移植の効果と比較検討する。臨床応用へ向け細胞移植もしくは分泌因子投与のいずれの方法が効果と安全性において優れているかを検討する。
＜分泌因子とエクソソームの作用因子同定とその分子機序の検討＞
歯髄幹細胞培養上清をフラクション化することで可能な限り不要物を除去すると同時に、効果のあるフラクションに絞りこまれた上清を用いて、プロテオーム解析法（HPLCやLC/MS解析）やサイトカインアレイを用いて効果を有する作用因子の同定を行う。また、in vitroでエクソソームの血管新生促進効果を確認後、エクソソームに含まれるmicroRNAに焦点を当てた分子学的作用機序を検討するため、エクソソームに含まれるmicroRNAを、アレイ法を用いて解析する。
＜糖尿病モデルマウスにおける分泌因子の虚血性疾患に対する効果の検討＞
4～6週齢のC57BL/6マウスの腹腔内へのstreptozotocin投与により1型糖尿病モデルマウスを、2型糖尿病モデルマウスとしてdb/dbマウスを使用する。血糖上昇確認後，大腿動脈を結紮することで後肢虚血を作り出す。その後、歯髄幹細胞培養上清，もしくは上記で解明しえた有効分泌因子をマウスの下腿筋肉内へ投与する。投与量と投与回数は増減調節し検討する。28日後まで、Laser Doppler perfusion imageを用いて、患側、健側の血流を継時的に評価する。

次年度使用額が生じた理由

我々は今回の研究の先行研究として，ヒト乳歯歯髄幹細胞（SHED）培養上清（SHED-CM）の糖尿病性神経障害に対する効果を報告している。その時に使用した細胞や試薬をはじめとする研究備品を有効利用することができたため、2020年度の費用を削減することができた。2021年度は2020年度に得た研究結果をより詳細に解明することを目的とするため、研究に用いる経費は増えることが想定されている。

研究成果

• [雑誌論文] Secreted factors from stem cells of human exfoliated deciduous teeth directly activate endothelial cells to promote all processes of angiogenesis. (2020)
  • 著者名/発表者名: Kato M, Tsunekawa S, Nakamura N, Miura-Yura E, Yamada Y, Hayashi Y, Nakai-Shimoda H, Asano S, Hayami T, Motegi M, Asano-Hayami E, Sasajima S, Morishita Y, Himeno T, Kondo M, Kato Y, Izumoto-Akita T, Yamamoto A, Naruse K, Nakamura J, Kamiya H.
  • 雑誌名: Cells 巻: 9(11) ページ: 2385
  • DOI: 10.3390/cells9112385.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Conditioned medium from dental pulp stem cells directly activate endothelial cells to promote all process of angiogenesis (2020)
  • 著者名/発表者名: M. Kato, S. Tsunekawa, N. Nakamura, E. Miura-Yura, Y. Yamada, Y. Hayashi, Y. Morishita, T. Himeno, M. Kondo, Y. Kato, H. Kamiya, K. Naruse, J. Nakamura
  • 学会等名: 56th Annual meeting European Association for the Study of Diabetes(EASD)
  • 国際学会
• [学会発表] 血管新生に対するヒト乳歯歯髄幹細胞培養上清の効果の検討 (2020)
  • 著者名/発表者名: 加藤 誠，恒川 新，中村 信久，井上 利恵子，林 優佑，三浦 絵美梨，山田 祐一郎，石川 貴大，森下 啓明，姫野 龍仁， 近藤 正樹，加藤 義郎，神谷 英紀，成瀬 桂子，中村 二郎
  • 学会等名: 第63回 日本糖尿病学会年次学術集会
• [学会発表] ヒト乳歯歯髄幹細胞培養上清が血管新生に及ぼす効果の検討 (2020)
  • 著者名/発表者名: 加藤 誠，恒川 新，中村 信久，井上 利恵子，林 優佑， 三浦 絵美梨，山田 祐一郎，森下 啓明，姫野 龍仁， 近藤 正樹，加藤 義郎，神谷 英紀，成瀬 桂子，中村 二郎
  • 学会等名: 第35回 日本糖尿病合併症学会