| 研究課題/領域番号 |
20K08891
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| 研究機関 | 静岡県立大学 |
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研究代表者 |
木村 俊秀 静岡県立大学, 薬学部, 准教授 (60404373)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 糖尿病 / インスリン / 膵B細胞 / シグナル伝達 / プロテオーム / タンパク質 / 低分子量Gタンパク質 / Rab27a |
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| 研究実績の概要 |
本研究ではARNOに着目し、その新たな結合候補タンパク質との結合特性や役割を解析することでエンドサイトーシスの開始シグナルの解明を目指す。エンドサイトーシスは、インスリン分泌の量とタイミングを決めるために必須であり、その破綻は2型糖尿病の新たな原因となりうる。しかし、これまでの研究ではインスリンを放出するまでの過程を扱い、その後のステップを扱った研究は皆無である。本研究は、申請者が同定したシグナルを解析することで、開口放出後のエンドサイトーシスシグナルの解明を行う。
本年度は、ARNOとその結合候補タンパク質の結合を生化学的に解析した。まず、結合候補タンパク質の特異的抗体とリコンビナントタンパク質を作製した。次に、免疫沈降実験より、ARNOとその結合候補タンパク質が細胞内で複合体を形成することを明らかにした。次に、結合候補タンパク質のフラグメントを作製し、ARNO結合ドメインの同定を試みた。
以上の結果より、ARNOとその結合候補タンパク質の結合様式が明らかになった。本研究成果は、次年度以降に行うARNOの活性制御機構を理解する上で極めて重要であると共に、GDP型Gタンパク質によるシグナリングという意味からも基礎生物学上重要な知見である。従って、本年度の研究計画は、当初の計画以上に進展していると考えている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本申請研究では、ARNOとその結合候補タンパク質が、グルコースによるエンドサイトーシスを制御するメカニズムを、以下に従って解明する。
令和2年度：ARNOとその結合候補タンパク質の結合を評価する。
令和3年度：同定したタンパク質がARNOを制御するメカニズムを解析する。
令和4年度：グルコースによるARNO結合候補タンパク質の活性化機構を解明する。
本年度は、ARNOとその結合候補タンパク質の結合様式を生化学的な手法により明らかにした。従って、本年度の研究計画は、おおむね順調に進展していると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度は、前年度の成果を基盤に同定したタンパク質がARNOシグナルに及ぼす影響を検討する。
1）申請者は、PIP3の細胞内産生量をモニターする系を既に立ち上げている(J. Cell Sci. 129,637-49,2016)。そこで、この手法を用いて、同定したタンパク質のノックアウトやノックダウン、ドミナントネガティブ変異体を発現したインスリン分泌細胞のPIP3量を計測する。
2）同定したタンパク質が制御するPI3キナーゼのアイソフォームを同定する。具体的には、各アイソフォームに特異的な阻害剤やsiRNAが、PIP3の産生やARNOの細胞内局在に及ぼす影響を調べる。
3）インスリン分泌細胞をグルコースで刺激し、同定したPI3キナーゼの細胞内動態を共焦点レーザー顕微鏡と全反射蛍光顕微鏡で解析する。さらに、同定したタンパク質のノックダウンや過剰発現がPI3キナーゼの細胞内動態に及ぼす影響を検討する。
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