| 研究課題/領域番号 |
20K08970
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| 研究機関 | 東京医科大学 |
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研究代表者 |
風間 宏美 東京医科大学, 医学部, 助手 (00339350)
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| 研究分担者 |
川原 玄理 東京医科大学, 医学部, 准教授 (40743331)
宮原 か奈 東京医科大学, 医学部, 講師 (90532391)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | アグリソーム / オートファジー / 小胞体ストレス / 乳がん / アポトーシス / ユビキチン / プロテアソーム / ヒストン脱アセチル化酵素６ |
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| 研究実績の概要 |
難治性の転移・再発乳癌において、細胞内の不良タンパク質（unfolded protein）はユビキチン化を受けて、プロテアソーム/オートファジーで分解処理される。しかし、この分解処理許容量を越えて蓄積する不良タンパク質は、微小管に沿って核近傍の微小管形成中心（MTOC）に逆行輸送されて凝集塊（アグリソーム）を形成する。このアグリソーム形成が小胞体（ER）ストレス緩和に寄与していることが明らかとなった。よって、効率的にアグリソーム形成を阻害する薬剤を既存薬剤の中から抽出し、プロテアソーム/オートファジー阻害剤と併用することでERストレスを最大限に誘導する薬剤コンビネーションを決定し、治療応用展開することが本研究の目的である。
転移性乳癌細胞株MDA-MB231細胞にプロテアソーム阻害剤ボルテゾミブを添加培養すると、MTOC領域にビメンチン抗体で強陽性に染色される凝集体が形成され、p62,ユビキチンと共局在していた。これより、この核膜近傍の凝集体がアグリソームと同定された。
そこで、このアグリソームを経時的に定量解析法を確立するために、MB231細胞に蛍光標識したビメンチン、ユビキチン、p62の各タンパク質の安定導入株の作製を行い樹立に成功した。（MDA-MB231-EGFP-vimentin, MB231-EGFP-Ub, MB231-EGFP-p62)
今後、これら細胞株を用いて、アグリソーム形成・阻害の定量解析法を確立する予定である。これをレポーターアッセイとして用いることで、プロテアソーム/オートファジー阻害剤により形成されるアグリソームをさらに阻害する薬理効果のある薬剤を、既存薬の中から同定し、ERストレス負荷を最大限に誘導する薬剤コンビネーションを決定していく予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
アグリソーム形成の経時的定量解析法を確立する上で不可欠な、ビメンチン、ユビキチン、p62の各タンパク質を蛍光標識した安定導入株の作製に予想外の時間を要したため。
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| 今後の研究の推進方策 |
応募者が樹立に成功した以下の各蛍光標識タンパク質の安定発現乳癌細胞株を用いることでプロテアソーム/オートファジー阻害剤処理によるアグリソーム形成の経時的モニタリングが可能となった。：MB231-EGFP-vimentin, MB231-EGFP-Ub, MB231-scarlet-Ub, MB231-EGFP-p62.
さらに生細胞イメージング装置IncuCyteを用いてタンパク質凝集体を測定することで，薬剤スクリーニングに適したアグリソームの「定量化」を確立する予定である。さらに、このアグリソーム形成の阻害活性が期待される微小管形成阻害剤、HDAC6阻害剤、ダイニン・モータータンパク質阻害剤との共培養により、アグリソーム形成阻害活性の高い薬剤を抽出し、ERストレス定量と並行して、最も殺細胞効果の高い薬剤コンビネーションを決定していく予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
COVID-19による輸入試薬等納品遅延のため。本年度予算と合算し,試薬消耗品として使用する予定である。
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