| 研究課題/領域番号 |
20K08989
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| 研究機関 | 自治医科大学 |
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研究代表者 |
山口 博紀 自治医科大学, 医学部, 教授 (20376445)
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| 研究分担者 |
北山 丈二 自治医科大学, 医学部, 教授 (20251308)
佐田友 藍 自治医科大学, 医学部, 助教 (40528585)
伊藤 大知 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 教授 (50447421)
相澤 健一 自治医科大学, 医学部, 准教授 (70436484)
宮戸 秀世 自治医科大学, 医学部, 講師 (90813163)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 腹膜播種 / 免疫チェックポイント阻害 / 抗PD-1抗体 / 腫瘍浸潤リンパ球 / 骨髄由来抑制性細胞 / フィブロネクチン |
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| 研究実績の概要 |
C57/Bl6マウスの同系胃癌細胞株YTN16を用いてIn vivo selection法にて腹膜高転移株YTN16Pを作成した。YTN16Pは、In vitroでは親株と比較して高い増殖能、浸潤能を有し、PD-L1より高率に発現しており、1x106個を腹腔内投与すると2週目には多数の腹膜播種を来した。また、ｍRNAの網羅的解析を行い、YTN16Pは親株と比べてフィブロネクチン(FN1)を多量に産生していた。そこで、shRNAを用いてYTN16PのFN knock down株を作成し、その機能を検討すると、In vitroでの増殖能や浸潤能は有意に減弱し、腹膜播種形成能も低下する傾向を認めた。
YTN16P(1x106細胞/1ml)を腹腔内投与後、7日目から3日毎に計4回、抗PD-1抗体またはIsotype control抗体を腹腔内または尾静脈から投与し、18日目に安楽死させ腹膜播種数を観察すると、腹腔内投与、全身投与ともに、播種数は対照群と比べて約半分程度に減少していたが、投与経路による差は認めなかった。これらのマウスの脾臓内免疫細胞の割合を検討すると、抗PD-1抗体を投与群では、CD4(+)やCD8(+)のTリンパ球の割合が増加し、CD11b(+)Gr-1(+)のGranulocytic-MDSC（G-MDSC）は低下する傾向を認めたが有意差は認めなかった。しかし、腹膜播種巣の切除検体の免疫染色にて、PD-1抗体で治療した腫瘍内に浸潤したCD8(+)T細胞の頻度は高く、G-MDSCは低い傾向を認めた。PD-1抗体は播種巣局所におけるがん免疫微小環境に変化をもたらし、腹膜播種に対しても抑制効果を発揮することが判明した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
免疫能を有するマウスを用いて同系胃癌の腹膜播種モデルを作成し、PD-1抗体を腹腔内投与すると、播種巣内の免疫細胞の割合の変化とともに腹膜播種に対しても抑制効果を発揮する事実が確認することができた。しかし、その抑制は十分ではなく、全身投与と腹腔内投与との間で播種抑制効果に顕著な差を認めなかった。一方、予想とは異なり、抗PD-1抗体は脾臓の免疫細胞の頻度には有意な変化はもたらさなかったが、腹膜播種内のT細胞の浸潤を促進していたことから、抗癌剤治療との併用でより強い抗腫瘍効果を誘導できる可能性があると考えられ、今後の検討課題とする。
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| 今後の研究の推進方策 |
PD-1抗体による腹腔内免疫の変化の検討: 腹膜播種マススにおいて腹腔内液から、遊離細胞を回収し、PD-1抗体の治療の有無による免疫細胞の変化を明らかにする。また、磁気ビーズ法を用いてT細胞を分離し、抗CD3抗体刺激による増殖能、IFN-gamma, perforin, granzyme 産生能をタンパク、mRNAレベルで測定する。腹腔内マクロファージを分離し、サイトカイン産生能を測定するとともに、健常マウス由来T細胞と混合培養しT細胞活性化能を検討する。これらの結果について対照群と比較検討し、PD-1抗体が腹腔内、播種巣内に及ぼす免疫応答の変化を明らかにする。
PD-1抗体の全身および腹腔内投与後の薬物動態の検討: 抗PD-1抗体を蛍光試薬FAM-Xにて蛍光標識し、腹膜播種マウスモデルの全身および腹腔内に投与し、１,3, 12, 24,48時間後にマウスを犠牲死させ、播種病変を採取、凍結連続切片を作成し、蛍光顕微鏡観察下に腫瘍内分布を観察、播種巣内の薬物分布の相違を明らかにする。さらに、血管、細胞障害性リンパ球、制御性T細胞、マクロファージ、MDSCを、異なる色素で標識したモノクロナル抗体で多重染色し、薬剤の空間的分布と浸潤免疫細胞、血管構築の変化の違いを検討する。
新規抗体製剤の作成と播種抑制効果の検討:PD-1抗体をハイドロゲルで封入した徐放性薬剤を作成し、上記のマウスモデルで、同様のスケジュールで腹腔内または尾静脈から投与し、抗腫瘍効果を検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
概ね予定通りに使用し、当初想定していた成果が得られている。旅費については発表を予定していた学会がオンライン開催となったため執行していない。前年度繰り越し分については、マウスを用いたin vivo実験と免疫学的機序の解明に必要な消耗品費として使用する予定である。
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