| 研究課題/領域番号 |
20K09114
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| 研究機関 | 国際医療福祉大学 |
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研究代表者 |
衣笠 哲史 国際医療福祉大学, 福岡看護学部, 教授 (90279266)
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| 研究分担者 |
溝口 恵美子 久留米大学, 医学部, 准教授 (40782157)
角田 俊之 福岡大学, 医学部, 准教授 (70444817)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 潰瘍性大腸炎 / CAC / claudin-2 / CEACAM6 / CHI3L1 |
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| 研究実績の概要 |
潰瘍性大腸炎（UC）におけるColitis Associated Cancer （CAC）にはポジティブフィードバック（PF）因子が関与するのではないかと仮定し、sporadic大腸癌患者の切除標本から①正常大腸粘膜組織、②大腸癌組織、癌合併潰瘍性大腸炎（以下CAC）患者の切除標本から③肉眼的な正常粘膜組織、④炎症部位組織、⑤癌組織 など手術標本を用いてcDNAマイクロアレイ解析を行った。上記、③と比較して⑤にて発現が増強しているが、①にくらべ②で発現が増強していない物質を検討した結果、接着性侵襲性大腸菌（Adherent Invasive E. coli: AIEC)に関与するCarcinoembryonic Antigen Related Cell Adhesion Molecule 6 (CEACAM6)、Chitinase 3-like1(CHI3L1)、Claudin 2, Phosphodiesterase 4(PDE4)等の遺伝子をPF因子の有力候補として同定した。上記⑤の組織における免疫染色でClaudin2、CEACAM6、CHI3L1のタンパク質レベルでの発現を検討したところ、癌組織の同じ部位にいずれも発現しているのを確認した。これらの分子のタンパク質発現が確認できたことから、その発現には相互作用があることが示唆される。Claudin 2の発現はMAPKにて調整されているが、CHI3L1は、腸管上皮のvitroの系でIL-13Rα2を介してMAPK/Erk、Akt/PKBおよびWnt/β-cateninなどのシグナル伝達を活性化することから、Claudin 2の異所性発現に関連している可能性がある。CEACAM6はAIECのreceptorで、クローン病患者の炎症悪化に関与しているとの報告があり、UCの炎症悪化にも関与している可能性が示唆される。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
我々がPF因子の有力候補として同定した AIECに関与するCEACAM6、CHI3L1、Claudin-2、 PDE4等は、上記⑤の組織における免疫染色でClaudin2、CEACAM6、CHI3L1のタンパク質レベルでの発現を確認できたことから、方向性は間違えていないことが判明した。そこで、大腸癌の細胞株を用いて、Claudin2、CEACAM6、CHI3L1をトランスフェクションして、それらのstable cell lines を作成中であるが、現時点では確立できていない。そのため、野生株とstable cell lines におけるサイトカインなどによる刺激でのシグナル伝達系の解析や細胞増殖、細胞極性の変化、3次元培養による細胞構築の変化などの検討がやや遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
PF因子を大腸癌細胞株に強制発現及びノックダウンし、炎症性サイトカインなどの発現、ヌードマウスによる生着能確認。SCVベクターにPF因子を組み込み、ウィルス作製し、HKe3細胞に感染させ安定発現細胞を樹立する。またUCやCACで発現が低下するPF因子に関しては、HCT116細胞にCas9発現レンチウィルスベクター及びPF因子に対するsgRNA発現レンチウィルスベクターを導入する。樹立した細胞株はヌードマウス（SHOマウス）に播種し、腫瘍増殖能を解析する。
Chitinase 3-like1(CHI3L1)タンパク質の結合タンパク質に関する解析を既に行っているので、UCの癌化(CAC)に重要な部位はCHI3L1どの部位であるか等を同定する。同定後にはその部位のアミノ酸配列による膜透過性ペプチドを作製し、抗炎症、抗腫瘍効果を検討する。
標的蛋白質をトランスフェクションした大腸癌細胞株と免疫細胞、およびAIECを共培養におけることで各々の細胞形態の変化や局在の変化、および浸潤能・増殖能などの変化を明らかにし、同時にPF因子により分泌されるサイトカインなどを確認する。PDE4のAIECによる影響も解析する。この解析には3次元培養も用いて細胞形態変化を確認する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
前述のごとく、標的分子が判明したためそれらの分子をトランスフェクションして、stable cell line を作成中である。これらの細胞株の確立に時間を要しており、次の実験段階に進めなかった。その影響で、サイトカインなどの消耗品購入を次年度に使用するということになった。この過程が、夏までには確立できそうだと考えている。その後は、前述の実験計画に沿って、必要なサイトカイン、抗体、培養液などの購入が必要となると考えている。
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