| 研究課題/領域番号 |
20K09211
|
|---|
| 研究機関 | 関西医科大学 |
|---|
研究代表者 |
中嶋 康文 関西医科大学, 医学部, 教授 (70326239)
|
|---|
| 研究分担者 |
竹下 淳 関西医科大学, 医学部, 研究医員 (40433263)
影山 京子 関西医科大学, 医学部, 研究医員 (80347468)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
|
| キーワード | microRNA |
|---|
| 研究実績の概要 |
健康成人被験者から、1回20ｍｌのクエン酸採血を行い、遠心操作にてHistopaque等を用いて好中球の分離を行った。
好中球の培養実験 糖濃度の異なる培養液を用いた好中球の培養系において、LPSを含有する培養液で24-48時間培養後、ホルボール12-ミリスチン酸13-酢酸塩（PMA）負荷し、好中球の脱顆粒化、NETs、ヒストンを蛍光色素染色後、蛍光倒立顕微鏡で観察、または培養後の回収液をフローサイトメーターで定量化し、対象群と比較検討した。（Joshi MB, et al. FEBS Letters 2013； 587： 2241–2246.）
好中球検体から、mirVanaTM miRNA Isolation Kit 等を用いてmiRNAを抽出した。
１）包括的miRNAの発現プロファイリング 定量性のある網羅的miRNAプロファイリングを、従来のマイクロアレイ法よりも、優れた次世代高速シーケンサーIon PGMシステム（Life Technology社)を用いる。２）Small RNAのライブラリ作成 Ion Total RNA-Seq Kitを用いる３）cDNAに変換、増幅 逆転写後、エマルジョンPCR法で、cDNAを増幅 ４）シーケンシング（３時間）シーケンサーによるmiRNA発現定量 ５）データ解析（１時間）サーバーにSFFまたはFASTQ形式データの転送 統計学的な有意差検定を伴う発現定量解析には、CLCバイオ社の解析ソフト（Genomic Work Bench）を使用する。選別されたmiRNAのターゲットとなる伝達RNAを複数のmiRNA Prediction Tool（Miranda, Target Scan Human5.0, PicTar, miRBase Targets Version 5.0）より、特にNETsを含む、細胞死・炎症惹起物質に関連する伝達RNAに相補配列のあるmiRNAを選別した。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
コロナ禍で、勤務時間に制限がかかったり、実験消耗品の納入が遅れることもあった。また、一部の実験内容を、外部委託しているが外部委託会社の勤務時間が短縮しているため、実験が部分的に遅れている。
|
| 今後の研究の推進方策 |
ICU入室患者を対象に、1)非敗血症患者、2) 耐糖能障害の無い敗血症患者、3) 耐糖能障害の有る敗血症患者から採血後、好中球を抽出し、細胞培養研究で検討した好中球の脱顆粒化、NETs、ヒストンの発現、及びmiRNA発現のデータの比較検討を行う予定にしている。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
研究実績の概要で記入した2020年度の以下の細胞培養実験系の追加実験のための消耗品を購入するために、繰り越した研究予算が必要である。糖濃度の異なる培養液を用いた好中球の培養系において、LPSを含有する培養液で24-48時間培養後、ホルボール12-ミリスチン酸13-酢酸塩（PMA）負荷し、好中球の脱顆粒化、NETs、ヒストンを蛍光色素染色後、蛍光倒立顕微鏡で観察、または培養後の回収液をフローサイトメーターで定量化し、対象群と比較検討する実験系の継続を行う。
また、臨床研究として、ICU入室患者を対象に、1)非敗血症患者、2) 耐糖能障害の無い敗血症患者、3) 耐糖能障害の有る敗血症患者から採血後、好中球を抽出し、細胞培養研究で検討した好中球の脱顆粒化、NETs、ヒストンの発現、及びmiRNA発現のデータの比較検討を新たに行うための次世代シーケンサー、細胞培養関連の消耗品購入のための研究予算が必要である。
|
