| 研究課題/領域番号 |
20K09443
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| 研究機関 | 近畿大学 |
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研究代表者 |
赤木 將男 近畿大学, 医学部, 教授 (00273441)
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| 研究分担者 |
橋本 和彦 近畿大学, 医学部, 講師 (10635569)
墳本 一郎 近畿大学, 医学部, 講師 (20770051)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 早期変形性膝関節症 / 軟骨下骨 / 骨粗鬆化 / 骨細胞 / アポトーシス |
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| 研究実績の概要 |
１）DMM (内側半月板不安定化) 手術：動物実験は全て医学部共同研究施設実験動物共同研究室の倫理委員会の承認を経て行った。実験には40週齢のC57BL/6雄マウスを使用し、左膝にDMM (内側半月板不安定化) 手術を全身麻酔下に施行した。まず、膝蓋骨近位から脛骨平原遠位まで約1cmの正中皮膚切開を行った。次に、内側傍膝蓋アプローチにて関節包を切開し、関節内内側から顆間領域を露出させた。Medial meniscus (MM)とMedial menisco-tibial ligament (MMTL)を同定した。その後、MMTLを尖刃刀で切離しMMが不安定化したことを確認した。生理食塩水で洗浄後に、関節包と皮膚を5-0ナイロンで閉創した。右膝にはSham手術（皮膚と関節包のみをDMM側と同様に切開、生理食塩水で洗浄後に同様に閉創）を実施した。手術後はケージ内で自然飼育とした。術後0, 1, 2, 4, 8週（各群n=3）でマウスを安楽死させた。
２）軟骨変性の評価：DMM手術後の経時的な軟骨変性の程度をSafranin-O染色により評価した。評価にはModified Mankin Scoreを用いた。DMM群ではSham群に比較して術後2週から軟骨変性が進行する傾向が認められ、術後4, 8週でModified Mankin Scoreには統計学的に有意な差を認めた。
３）軟骨下骨骨粗鬆化の評価：脛骨骨端線より近位の骨量を新たに購入したマイクロCT（Rigaku社製のCosmo Scan GXⅡ）を使用して行った。撮影条件は148μm等方性ボクセルサイズ、電圧90kV、電流88μA、撮影時間は4分とした。解析パラメーターは軟骨下骨のbone volume density (BV/TV)とし、マイクロCTに付属の自動解析ソフトを使用して評価した。DMM群ではSham群に比較して術後1-2週からBV/TVが減少する傾向が認められ、術後4, 8週で統計学的に有意な差を認めた。
４）各群はn=3と少なくデータの信頼度は低いが、DMM手術により、関節軟骨と軟骨下骨の骨粗鬆化が同時に進行する傾向があることが分かった
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
予備的実験としてはおおむね順調で予想された結果が得られたと考える。今後は評価の精度を高めるため、DMM群とSham群をマウス個体ごとに分け（右膝のみの手術とする）、各群n=6として術後0, 1, 2, 4, 8週で安楽死させて経時的な観察を行う。
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| 今後の研究の推進方策 |
予定通りDMM手術によるマウス膝変形性膝関節症（OA）モデルを用いて研究を進める。組織学的評価として関節軟骨の評価（Mankin score）に加え、軟骨下骨における破骨細胞数の評価（TRAP染色）、骨組織の免疫組織学的検討（骨細胞のアポトーシス（Casp3発現）とRANKL発現）を行う。また、フクシン染色を用いて軟骨下骨プレートや骨梁におけるマイクロダメージの評価を行う。マイクロCTによる軟骨下骨の評価では、完全な自動化ではなく、一部マニュアル操作を加えて評価精度を高める。脛骨骨端線より近位の骨量、骨梁構造の変化を調べる。さらに、抗RANKL抗体(OYC1)および抗アポトーシス薬剤QVD (ApInh)の投与により軟骨下骨骨量低下と軟骨変性の進行を抑制できるかを術後4週および8週において確認し、我々の仮説を検証する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
実験室内に既存の試薬を使用することが出来た為、試薬購入費用が予算額を下回ったが、令和3年度に高額な抗体を購入予定であり、令和2年度未使用額は令和3年度に使用予定である。
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