| 研究課題/領域番号 |
20K09451
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
谷口 優樹 東京大学, 医学部附属病院, 特任准教授 (80722165)
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| 研究分担者 |
齋藤 琢 東京大学, 医学部附属病院, 准教授 (30456107)
大島 寧 東京大学, 医学部附属病院, 准教授 (50570016)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | Runx2 / Runx3 / 変形性関節症 / RNAシークエンス / ChIPシークエンス |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、増え続けている運動器変性疾患の代表例である変形性関節症（OA)の新規治療標的を解明するべく、軟骨を変性させるシグナルの一つである軟骨内骨化の中心に位置する転写因子Runx2およびRunx3の機能解析を目的に各実験を開始している。
最初にWTマウスの解析で、OAが進行してもRunx2は深層で発現が維持されて、Runx3は漸減することが判明した。続いて薬剤誘導性に時期特異的・関節軟骨特異的をノックアウトできるCol2a1-CreERT2マウスとRunx2, 3のfloxマウスを交配させてOAの解析やin vitroでの解析を行った。Runx2はヘテロノックアウトではOAが抑制され、ホモノックアウトではOAが進行するという二層性の変化を示した。Runx3のノックアウトマウスの膝ではOAが進行した。また関節軟骨表層でノックアウトするPrg4-CreERT2;Runx3fl/flマウスでも同様にOAが進行した。さらに各ノックアウトマウスとコントロールマウス由来の軟骨細胞の解析を行った。これに並行して、正常細胞とRunx2, 3のノックアウト細胞との間でRNAシーケンスによる発現量の比較を行った。Runx2は既存の報告通り軟骨基質破壊因子であるMmp13だけでなく、ある特殊な培養条件下で軟骨保護因子であるCol2a1を、誘導することが示唆される結果となった。一方で、Runx3は表層由来の軟骨細胞で関節潤滑に関わるPrg4を、また深層由来の軟骨細胞では軟骨保護因子であるAcanを、それぞれ誘導することが示唆される結果となった。
現在、転写因子であるRunx2とRunx3の軟骨細胞での転写標的を探るべく、ChIPシークエンスを計画している段階である。この解析を行うことで、ゲノムにおいて対象遺伝子のどの部位に、どういった塩基配列にRunx2/Runx3が結合して機能しているのかが明らかになる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初のプランでは、(1)in vivoで関節軟骨の各層におけるRunx2, 3の機能解析、(2)in vitroで関節軟骨の各層におけるRunx2, 3の転写標的の解析、（３）関節軟骨の各層におけるRunx2, 3の共役分子の探索を網羅的に行うことを計画した。
最初にWTマウスに外科的手術を行い、継時的にサンプルを採取して解析したところ、OAが進行してもRunx2は深層で発現が維持されて、Runx3は漸減することが判明した。続いてタモキシフェン誘導性に関節軟骨で対象をノックアウトできるCol2a1-CreERT2マウスとRunx2, 3のfloxマウスを交配させてOAの解析やin vitroでの解析を行った。Runx2はヘテロノックアウトではOAが抑制され、ホモノックアウトではOAが進行するという二層性の変化を示した。Runx3のノックアウトではOAが進行した。また関節軟骨表層でノックアウトするPrg4-CreERT2;Runx3fl/flマウスでも同様にOAが進行した。
この原因としてin vitroでは、各ノックアウトマウスとコントロールマウス由来の軟骨細胞の解析を行った。正常細胞とRunx2, 3のノックアウト細胞との間でRNAシーケンスによる発現量の比較を行い、Runx2が軟骨保護因子に重要なCol2a1を、Runx3は関節潤滑に関わるPrg4を、それぞれ誘導することが示唆される結果となった。まとめると、当初のプランの(2)まで順調に推移している。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在、上述した通りおおむね順調に経過しているため、現在ChIPシークエンスを効率的に行うためのFLAGタグのついたRunx2, Runx3を発現するベクターを作出している。当初メインに想定していたRunx2/Runx3を標的としたChIPシークエンスを進めていく予定としている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
マウスが安定的にMatingを繰り返して実験サンプルが供給されるようになり、購入試薬の調整がしやすくなった。またRNAシークエンスが当初予定していたより安価で対応できた。
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