| 研究課題/領域番号 |
20K09470
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| 研究機関 | 独立行政法人国立病院機構(相模原病院臨床研究センター) |
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研究代表者 |
田中 信帆 独立行政法人国立病院機構(相模原病院臨床研究センター), 外科系リウマチ研究室, 研究員 (60530920)
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| 研究分担者 |
福井 尚志 独立行政法人国立病院機構(相模原病院臨床研究センター), 政策医療企画部, 特別研究員 (10251258)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 変形性膝関節症 / タンパク分解酵素 / 軟骨変性 / 痛み |
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| 研究実績の概要 |
変形性関節症（OA）ではMMP-13やADAMTS-4、5など種々のタンパク分解酵素の作用によって軟骨基質の変性が進むと考えられている。このためタンパク分解酵素の発現については今までに多くの研究がなされてきた。しかしこれらの酵素ははじめ活性のない潜在型として産生されたのち、活性化の過程を経て初めてタンパク分解活性を示すようになる。このためタンパク分解酵素の活性化の過程は酵素の産生以上に重要とも考えられる。しかし今までのところOA関節におけるタンパク分解酵素の活性化については、ごく限られた知見しか得られていない。
本研究の研究代表者（以下、代表者）はOA軟骨の解析を様々な方向から行っていく中で、軟骨の肉眼的な変性部において非変性部に比してurokinase（uPA）の発現が亢進し、プラスミンの活性も上昇していること、およびOAの痛みに深く関与するnerve growth factor（NGF）の発現が亢進していることを見出した。プラスミンはそれ自体がアグリカンを分解する作用を持つほか、種々のMMPを活性化する作用があり、その作用によっても軟骨基質の変性を強力に推し進めている可能性がある。また膝関節のOAについては、今までの多くの疫学研究において痛みと進行がリンクしていること、すなわち軟骨の変性消失が速やかに進む症例において痛みが強い傾向があることが示されているが、軟骨変性部においてプラスミンの活性とともにNGFの産生が亢進していたことは、この痛みと進行のリンクを説明する現象なのかもしれない。本研究では、これらの知見に基づき、軟骨変性部においてプラスミン活性が亢進する機序とNGFの発現が誘導される機序を明らかにすることを目的に研究を行うことを予定した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究では研究初年度の2020年度に軟骨変性部において非変性部に比してuPA以外にPAI-1の発現が亢進していること、またuPAと同様にプラスミン活性の発現に関与するtissue-type plasminogen activator （tPA）の発現も亢進していることが明らかになった。またOA軟骨からPBS中のホモジナイズによって得られたタンパク抽出液（以下、OA軟骨抽出液）中に軟骨細胞に対してuPAの発現を亢進させる因子が存在すると思われることを明らかにした。さらにOA軟骨抽出液は軟骨細胞に対してNGFの発現を亢進させる作用も示すこともわかった。
研究第二年度の2021年度には前年度の知見に基づき、OA軟骨の変性部と非変性部におけるプラスミノーゲンアクチベーターの活性について検討した。OA軟骨変性部からの抽出量はuPAに比してtPAが数倍多く、この知見に基づきOA軟骨の非変性部と変性部からのタンパク抽出液中のtPAの活性を計測したところ、変性部からの抽出液中のtPAの活性のほうが明らかに高いことがわかった。さらにOA軟骨変性部からの抽出液について、tPA活性とプラスミンの活性の間には統計学的に有意の正の相関が認められた。
2021年度にはさらにOA軟骨からの抽出液中に含まれ、軟骨細胞に対してuPA、NGFの発現を引き起こす因子の特定を進めた。文献情報の調査から、軟骨細胞に対してuPA、NGFの発現を誘導しうる因子としてTGF-β1が見いだされた。つぎにTGF-β1の受容体であるTGF-βRIに対する特異的な阻害剤SB431542 を用いた実験を行ったところ、この阻害剤によって軟骨抽出液によるuPA、NGFの発現の誘導がほぼ完全に抑止された。この結果から代表者らはOA軟骨には活性型のTGF-β1が含まれ、これがuPA、NGFの発現を誘導している可能性があると考えるに至った。
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| 今後の研究の推進方策 |
2021年度には前項で述べたように①軟骨変位部におけるプラスミン活性の発現には当初予想したuPAではなくtPAが大きく関与していると考えられること、および②OA軟骨には活性型TGF-β1が生理学的に有意な量で含まれており、これが軟骨変性部においてuPAとNGFの発現を引き起こしている可能性を見出した。研究第3年度に当たる2022年度にはこれらの知見を元に、以下の2つの検討を行う。
検討の第一は、軟骨変性部においてtPAの発現が亢進する機序の解明である。代表者はすでにOA軟骨からのタンパク抽出液を培養軟骨細胞に加えてもuPAやNGFと異なりtPAの発現は上昇しないことを確認しており、OA軟骨変性部におけるtPAの発現亢進の機序はuPAとは異なるであろうことを明らかにしている。2022年度はその機序の解明を目指して研究を行う。今までにtPAの発現はいくつかのサイトカインや成長因子によって誘導されることが報告されている。また血管内皮細胞においては力学的なストレスによってtPAの発現が誘導されることも知られている。2022年度には培養軟骨細胞を用いた実験を行い、これらの可能性について検討する。
検討の第二はOA軟骨変性部におけるuPA、NGFの発現に対するTGF-β1の関与の程度の推定である。この実験ではOA軟骨変性部から採取された軟骨組織を二等分して それぞれを器官培養で維持し、一方にSB431542を加えてuPA、NGFの発現がそれぞれどの程度低下するかを調べることでTGF-β1の関与の程度を推定する。またこの実験でTGF-β1の関与が確認された場合、さらにOA軟骨抽出液中の活性型TGF-β1の定量的計測を行う。TGF-β1活性の計測についてはInvivo社から発売されているHEK-Blue TGF-βを用いたbiological assayを行うことを予定している。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
参加した学会がウェブ開催となったため旅費が不要となり、主にその分を次年度に繰り越した。繰り越した研究経費については次年度において試薬購入に充てる予定である。
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