| 研究課題/領域番号 |
20K09472
|
|---|
| 研究機関 | 北海道大学 |
|---|
研究代表者 |
太田 昌博 北海道大学, 医学研究院, 客員研究員 (70823334)
|
|---|
| 研究分担者 |
高畑 雅彦 北海道大学, 医学研究院, 准教授 (40374368)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
|
| キーワード | 異栄養性石灰化 / 慢性炎症 / 石灰化抑制機構 / ピロリン酸代謝 |
|---|
| 研究実績の概要 |
マウスの靭帯，腱由来の初代培養線維芽細胞を用いて，IL-6，TNFα，その同時刺激によってプロリン酸PPi代謝関連酵素群がどのような挙動を示すかを調査した．具体的には，①PPi産生酵素ENPP1，②PPi輸送タンパク質ANK，③PPi分解酵素/IP産生酵素：TNAPの発現変動をmRNAで確認した．PPi代謝関連酵素群はIL-6，TNFα同時刺激によって産生と分解のバランスに異常が生じることがわかった．このバランス異常は刺激後日数がたつにつれて顕著になることから即時的反応だけでなく2次的におこる何らかの変化によってもたらされている可能性が示唆された．さらに培養液中のPPi濃度も刺激後1週間程度で有意な変化がでてくることもこの考えを裏付ける結果と考えられた．
倫理委員会の承認を得た上で，患者の同意も得て採取した脊柱黄色靱帯石灰化症あるいは骨化症患者の切除組織サンプルを用いて組織学的検討を行なった．TNFα，IL-6を含む炎症性サイトカインの影響を線維芽細胞が受けているか否かの間接的証拠を得るためSTAT3，NFkappa-B免疫染色を行った．若年者正常靭帯組織と異なり，患者サンプルではSTAT3，NFkappa-B陽性細胞比率が多かったことから脊柱黄色靱帯石灰化症あるいは骨化症患者の靭帯は炎症の影響を受けていることが確認された．
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
培養細胞を用いた実験は比較的均一な条件で飼育されたマウスの細胞を用いて行い，再現性のある結果を得ているが，ヒト靭帯由来細胞は年齢や性別，病気の状態などが一定しておらず，安定した結果が得られていない．比較対象の年齢，性別，併存症などの条件によっても炎症性サイトカインに対する応答が異なることが原因と考えられる．ただし，同一サンプル由来の患者内比較では炎症によってPPi代謝バランスに変化がでるという現象は確認できている．
弾性繊維の変性断裂や終末糖化産物(AGE)などの蓄積によって線維芽細胞にIL－6 誘導性炎症アンプが誘導され，さらに石灰化が誘導されるかを検証するための動物モデル実験は2年目より開始している．初年度はCOVID19流行による所属組織における研究活動の制約が続いたこともあり，長期的な観察が必要な動物モデル実験開始時期を遅延させざるを得なかった．
ヒト靭帯組織標本を用いた研究では，靭帯骨化症の組織は通常の脱灰組織標本でも観察可能であるが，石灰症の場合は病変が脱灰されてしまうとどの部位に石灰が沈着していたかが特定できないことがわかった．非脱灰標本では石灰化の位置はわかるものの，たくさんの切片の作成が難しいことや免疫染色にも制限がある．正確な石灰化部位はわからないが脱灰標本を用いてSTAT3，NFkappa-B免疫染色を行ったところ，患者サンプルでは非石灰化靭帯組織と比較してSTAT3，NFkappa-B陽性線維芽細胞比率が多いことがわかった．
|
| 今後の研究の推進方策 |
ヒト靭帯由来細胞は年齢や性別，病気の状態などが一定しておらず，安定した結果が得られていない．年齢，性別，併存症などをマッチングさせた患者から得た細胞を使用することや，患者内比較データなどを用いて普遍的な現象としての炎症アンプによるPPi代謝への影響の解明を目指す予定である．
Zucker Fatty ratを用いた検討はすでに開始している．目的を達成するのに必要な観察期間が定まっていないため，短期試験と長期試験を組み合わせて実験を行う予定である．また炎症アンプによるPPi代謝異常が確認され次第，マウスモデルを用いた炎症抑制を目的とした治療介入実験へと進める予定である．
臨床CTで石灰沈着が確認されている靭帯組織出脱灰標本でPPi関連分子の免疫染色と炎症性サイトカイン下流分子の共局在などを調べることにより炎症によるPPi代謝異常が異所性石灰化に関わるかどうかを明らかにします．
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
COVID19流行による所属組織における研究活動の制約が続いたこともあり，長期的な観察が必要な動物モデル実験開始時期を遅延させざるを得なかったため．
|
