肩腱板enthesis再生のためのSox9/Scx標的遺伝子検索と機能解析

2020 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 20K09482
• 研究機関: 鹿児島大学
• 研究代表者: 前田 真吾 鹿児島大学, 医歯学総合研究科, 特任准教授 (60353463)
• 研究分担者: 谷口 昇 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 教授 (20626866)
• 研究期間 (年度): 2020-04-01 – 2023-03-31
• キーワード: enthesis / Sox9 / Scx

研究実績の概要

本研究目的は、Sox9とScxが協調的に誘導する標的遺伝子を同定し、in vitroとin vivoでその機能、すなわちenthesis再生における役割を解析する事である。腱板修復にはenthesis再生が不可欠である事、enthesis形成にはSox9+/Scx+ statusの細胞が重要である事に立脚し、Sox9とScxが協調的に誘導する未知のenthesisマスター因子と呼ぶべき特異的遺伝子を同定し、これを治療分子標的として機能評価する事である。その観点に立ち、まずSox9とScxを同時に誘導できる因子の検索を行った。マウス間葉系幹細胞(MSC)、ATDC5細胞、そしてC3H/10T1/2細胞など、軟骨細胞腱細胞両分化ポテンシャルを持つ細胞を用いた。Enthesis再生にTGF-βとBMP(共にTGF-βファミリー分子群)の必要性が報告されているので、商品ベースで購入可能な各種TGF-βファミリー・リガンド(TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, myostatin, activin A, BMP-2, BMP-3, BMP-6, BMP-9, BMP-10, BMP-14, GDF-3, GDF-6, GDF-7, GDF-9, GDF-15, nodal, inhibin A, Lefty A)をそれぞれ添加して、より強力な誘導因子を検索した。その結果、TGF-β1, TGF-β2, myostatin, activin AにSox9/Scx double positive状態を誘導する能力があることが分かった。
一方、Sox9とScxの共通標的遺伝子を検索するためのツールとして、両者の発現ベクター、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)の作製に着手し、進行中である。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

研究は、おおむね計画通りに進んでいる。

今後の研究の推進方策

[Sox9/Scxの標的遺伝子の検索]第1次スクリーニング：次の条件を満たす遺伝子群を検索する。(ア)TGF-β1刺激で発現変化 (up/down)(イ)Sox9、Scxそれぞれ単独の過剰発現では発現変動しないが、二者同時に作用させると2倍以上の変動。(ウ)Sox9/Scxのloss-of-functionにて逆の発現変動。(エ)既知の軟骨細胞や線維芽細胞、腱・靭帯細胞の発現(マーカー)遺伝子は除く。以上をマイクロアレイ解析にて検索する。過剰発現には動物実験を見据えてアデノ随伴ウイルス(AAV)を用いる。Loss-of-function実験はsiRNAノックダウン（効率が悪ければCRISPR/Cas9ノックアウト）にて行う。
第2次スクリーニング：腱板形成において、Sox9/Scx共発現は、BMPやIhhが作用して線維軟骨が石灰化するフェーズでは消失する事から、enthesis決定遺伝子はBMP/Ihhシグナルによって発現変動を受けると予想する。したがって、第1スクリーニングで抽出された遺伝子群のうち、BMP(BMP-2)あるいはIhh刺激によって発現変化するものをさらに絞り込む。(ア)抽出遺伝子の過剰発現(AAV6, プラスミド)やsiRNA導入によるMSCの分化への影響を、軟骨と腱・靭帯 のマーカーの定量的RT-PCR法やウエスタン・ブロット法で解析する。(イ)正常マウスの腱板enthesisのパラフィン切片を作製し、対象遺伝子の抗体が入手可能なら免疫組織化学染色を、ない場合はin situ hybridization を施行して、発現分布、特にenthesisの4層構造のどこに発現するか、高齢変性と共に変化するかも含めて観察する。

次年度使用額が生じた理由

残った次年度使用額は、抗体やキットが購入できない程の少額であり、今後問題なく使用予定である。

研究成果

• [雑誌論文] BMP-induced Atoh8 attenuates osteoclastogenesis by suppressing Runx2 transcriptional activity and reducing the Rankl/Opg expression ratio in osteoblasts (2020)
  • 著者名/発表者名: Yahiro Yuhei、Maeda Shingo、Morikawa Masato、Koinuma Daizo、Jokoji Go、Ijuin Toshiro、Komiya Setsuro、Kageyama Ryoichiro、Miyazono Kohei、Taniguchi Noboru
  • 雑誌名: Bone Research 巻: 8 ページ: 32 (2020)
  • DOI: 10.1038/s41413-020-00106-0
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] BMPシグナルと骨軟骨代謝~ Negative feedback機構 ~ (2020)
  • 著者名/発表者名: 前田 真吾, 城光寺 豪, 伊集院 俊郎, 河村 一郎, 今村 勝行, 栫 博則, 篠原 直弘, 八尋 雄平, 谷口 昇
  • 学会等名: 第35回 日本整形外科学会基礎学術集会
• [備考] 日本骨代謝学会：1st Author
  • URL: http://www.jsbmr.jp/1st_author/426_smaeda.html