| 研究課題/領域番号 |
20K09543
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| 研究機関 | 横浜市立大学 |
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研究代表者 |
富澤 信一 横浜市立大学, 医学部, 講師 (00704628)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 不妊 / 精子形成 / エピジェネティクス / Kmt2b / ヒストン修飾 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では雄性不妊メカニズムの解明に向け、精子形成に必須なヒストンメチル化酵素KMT2Bが制御する遺伝子の同定と機能解析を目的としている。これまでに、KMT2Bは精子幹細胞の分化に必須であることや、KMT2Bは精子形成後半に必要な遺伝子セットにあらかじめH3K4me3を導入していることが明らかとなっている。そこで本研究では、KMT2Bが制御する遺伝子の一つとして同定したTsga8遺伝子と、TG2遺伝子の機能解析を実施した。
まずCRISPR-Cas9を用いてTsga8遺伝子ノックアウトマウスを作製したところ、このマウスは精子細胞の発生異常による不妊症を発症することが示された。さらに、Tsga8が精子形成時に起きるX染色体の遺伝子活性化に必要であることが明らかになった。
一方で、TG2遺伝子の解析の結果、TG2は精母細胞から精子細胞において発現する遺伝子であり、そのノックアウトマウスも精子細胞発生の著しい障害による不妊を呈することがわかった。組織学的な解析からは、TG2が円形精子細胞から伸長精子細胞への移行に必要であることが示された。精巣全体や円形精子細胞を用いたトランスクリプトーム解析では、TG2遺伝子欠損精巣および精子細胞が顕著な炎症を示すことがわかったため、TG2がプロテアーゼの正常なネットワークの維持や、炎症の抑制に関わる可能性が示唆された。
KMT2Bが制御する遺伝子は他にも多く存在し、その多くは未解析のため、それらの中には上記2遺伝子と同様に精子細胞発生や雄性不妊に関わる遺伝子が存在していることが推測される。このことから、本研究ではKMT2Bによる精子形成メカニズムの一端が明らかになったと考えることができる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
これまでに、本研究で目的としたKMT2Bが制御する遺伝子の機能解析の大部分を進め、重要な結果を得ることができた。
まず、制御遺伝子の1つ目であるTsga8遺伝子のノックアウトマウス作製と精子形成における機能解析を実施した。組織学的解析やトランスクリプトーム解析を実施することにより、Tsga8が精子細胞の発生に欠かせない役割を有することを初めて見出し、Tsga8と不妊症との関連性を明らかにした。この研究成果は論文で報告済みである(Kobayashi, Tomizawa et al., Development, 2021, 148:dev196212)。
次に、KMT2Bの2つ目の制御遺伝子として同定したTG2遺伝子のノックアウトマウスの作製を行った。その結果、TG2遺伝子欠損マウスも精子細胞の発生において高発現し、必須の役割を有することが明らかになった。そこで、これまでにTG2ノックアウトマウスの精巣を用いた免疫組織学的解析や電子顕微鏡解析を実施し、精子細胞の形態形成異常を高解像度で解析してきた。さらに、ノックアウトマウスの精巣や精子細胞を集めたトランスクリプトーム解析を行ったところ、TG2がプロテアーゼのネットワーク維持や炎症の抑制などの重要な現象に関わることが明らかになってきている。
このように、精子幹細胞においてKmt2b制御下にあり正常な精子形成や不妊症の発症に関わる遺伝子を複数同定できたことから、本研究はおおむね順調に進展していると判断できる。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後はTG2遺伝子の機能解析をさらに進める。これまでに明らかになったTG2と炎症やプロテアーゼ系の関係性に関して追加の組織学的解析を実施する。特に、それらにかかわる重要なタンパク質がTG2のノックアウトマウス精巣においてどのように変化しているかを解析する。また、並行してトランスクリプトームデータの解析を実施し、遺伝子発現の変化とタンパク質の変化を統合して調べることを計画している。これらの実験が進めば、TG2による精子形成制御メカニズムをより深く解明することに繋がるため、雄性不妊の発症との関連がさらに明確になる。その後、これまでの研究成果と併せて論文化することを目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
これまでに得られた研究結果より、Kmt2b制御下にあるTsga8とTG2遺伝子の雄性不妊への関与が明らかとなった。その内TG2遺伝子に関しては、多数のサンプル採取からトランスクリプトーム解析を実施するまでに時間を要し、その結果を組織学的解析により検証するための実験を次年度に持ち越したため残金が生じた。次年度の使用額は主にTG2ノックアウトマウスを用いた組織学的な追加実験に用い、これにより研究をさらに発展させた上で論文投稿を行うことを計画している。
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