2021 年度実施状況報告書

腎細胞癌におけるエネルキー代謝異常とがん免疫回避機構の分子細胞学的な解析

研究課題

研究課題/領域番号	20K09546
研究機関	獨協医科大学
研究代表者	釜井隆男獨協医科大学, 医学部, 教授 (80316562)
研究期間 (年度)	2020-04-01 – 2023-03-31
キーワード	腎細胞癌 / HLRCC / FH / SDH / Keap1 / NGS
研究実績の概要	令和3年度においては、癌組織でのFH・SDHおよびNrf2・Keap1遺伝子異常の検索、免疫回避機構に関与しているPD-L1・制御性T細胞（Treg）・tumor-associated macrophages (TAMs) の遺伝子異常および熱ショックタンパク質（Heat Shock Protein, HSP）の遺伝子異常)を検討した。作年度作成した44種類の因子に対する684ampliconのprimerを使用し、腎癌症例32例と尿路上皮癌症例32例につき手術により摘出した組織を用い、QIAamp DNA Mini Kitを用いてDNAを精製し、次世代シークエンス（Next Generation Sequencing, NGS）法により解析を行った。得られた解析結果を8グループに分け詳細に検討を行った。 1）SDHA, SDHB, SDHC, SDHD, FH　2）KEAP1, NFE2L2　3）PBRM1, BAP-1, VHL　4）AKT1, PTHRP, RET　5）RhoA, RHOB, RHOC, RHOG, ROCK1, ROCK2 ,ARHGDIA, ARHGDIB, ARHGDI, KRAS　6）cAMP, CD4, CD8, PD-1, PD-L1(B7-H1), CTLA, B7-H4, CD39(ENTPD1), CD73(5'-NT,NTSE), ADORA2B, ADORA2A　7）HIF1A, HIF1B, HIF2A, HIF2B　8）HSP90AA1, HSP90AB1, HSP90B1, TRAP1, HSF1 検出された遺伝子変異に基づき、変異数を0・1・2・3-5・6-9の5群に分け検討した。また、変異の種類についても検討し共通変異が何例に認められたか、更に終止コドンとなる変異およびフレイムシフト変異が何例に認められたかについて検討を行った。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由摘出した組織よりQIAamp DNA mini kitを用いてDNAを抽出した。Invitrogen Qubit 4 Fluorometerを用い、抽出したDNAの濃度を正確に測定し、1ngの DNAを出発材料としIon AmpliSeq Library Kit 2.0を用いてライブラリーを作製した。テンプレート調製にはIon Chefシステムを用い、Ion GeneStudio S5 systemを使用しシーケンシングを行うことにより、正確な結果を得ることができた。変異検出は、得られた結果をThermo Fisher Scientific社が提供するクラウドサービスであるTorrent Suiteソフトウェアまたは Ion Reporterソフトウェアを用いて解析することにより、詳細に検討することができた。
今後の研究の推進方策	令和3年度においては、癌組織でのFH・SDHおよびNrf2・Keap1遺伝子異常の検索、免疫回避機構に関与しているPD-L1・制御性T細胞（Treg）・tumor-associated macrophages (TAMs) の遺伝子異常および熱ショックタンパク質（Heat Shock Protein, HSP）の遺伝子異常)を検討した。昨年度作成した44種類の因子に対する684ampliconのprimerを使用し、腎癌症例32例と尿路上皮癌症例32例につき手術により摘出した組織を用い、DNAを精製し、次世代シークエンス（Next Generation Sequencing, NGS）法により解析を行った。その結果重大な遺伝子変異を起こす可能性がある終止コドンとなる変異およびフレイムシフト変異が認められた。今後さらに症例数を増やし、それらの遺伝子変異および症例の病期との関連について詳細に検討を行う。