ホスホイノシチド動態制御を介したヒトパピローマウイルス潜伏感染機構の解明

2020 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 20K09682
• 研究機関: 国立感染症研究所
• 研究代表者: 柊元 巌 国立感染症研究所, 病原体ゲノム解析研究センター, 室長 (70291127)
• 研究分担者: 佐々木 雄彦 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 教授 (50333365)
• 研究期間 (年度): 2020-04-01 – 2023-03-31
• キーワード: HPV / ホスホイノシチド

研究実績の概要

細胞内セカンドメッセンジャーとして働く重要な内在性分子であるホスホイノシチドのHPVゲノム複製への関与を検討した。HPV16ゲノムを保持するU2OS/HPV16細胞及び親株U2OS細胞から、クロロホルム/メタノール/HCl混合液の添加により、脂質画分を有機溶媒層に抽出し、逆相カラムクロマトグラフィーによる脂質分子の分離と質量分析装置によるLC-MS/MS質量分析によって、細胞内のホスホイノシチド分子種の検出・定量を行った。その結果、U2OS/HPV16ではU2OSと較べて、8種類のホスホイノシチド分子の内、PIP3レベルが低下していることが示された。PIP3を脱リン酸化するPTENの活性が、U2OS/HPV16で上昇していることが示唆された。
そこでPTEN活性がHPV DNA複製に及ぼす効果を、培養細胞での一過性HPV複製系で検討した。HPV複製オリジン配列をルシフェラーゼプラスミドに組み込み、ヒト子宮頸癌細胞C33AにてHPV複製タンパク質E1/E2の共発現によりオリジンプラスミドの複製を誘起して、HPV複製レベルをルシフェラーゼ活性により定量化する細胞アッセイを用いた。C33Aは内在性PTENの発現が認められないが、発現プラスミドの導入によりFLAGタグ付きPTENを過剰発現させるとHPV DNA複製が約30%抑制された。一方、酵素活性を失ったPTEN変異体（C124S, G129E）では抑制効果が若干減弱した。これらの結果から、PTEN活性の上昇によりウイルスゲノム複製が低レベルに抑えられることが、宿主免疫系から逃れるHPVの潜伏持続感染につながっている可能性が考えられた。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

HPV16ゲノム保持細胞にてホスホイノシチド分子種の定量を行うことで、HPVゲノム維持に関わるホスホイノシチド候補が得られており、当初の研究計画に沿って進捗している。

今後の研究の推進方策

U2OS/HPV16及びU2OSからRNAを調製してRNA-seq解析を行い、HPVゲノム維持に伴って発現が上昇または減少するホスホイノシチド特異的キナーゼ・ホスファターゼを探索する。

次年度使用額が生じた理由

年度末納品等にかかる支払いが令和3年4月1日以降となったため。当該支出分については次年度の実支出額に計上予定であるが、令和2年度分についてはほぼ使用済みである。

研究成果

• [雑誌論文] Changes to the cervicovaginal microbiota and cervical cytokine profile following surgery for cervical intraepithelial neoplasia (2021)
  • 著者名/発表者名: Kawahara R, Fujii T, Kukimoto I, Nomura H, Kawasaki R, Nishio E, Ichikawa R, Tsukamoto T, Iwata A.
  • 雑誌名: Sci Rep 巻: 11 ページ: 2156
  • DOI: 10.1038/s41598-020-80176-6.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] High levels of within-host variations of human papillomavirus 16 E1/E2 genes in invasive cervical cancer (2020)
  • 著者名/発表者名: Hirose Y, Yamaguchi-Naka M, Onuki M, Tenjimbayashi Y, Tasaka N, Satoh T, Tanaka K, Iwata T, Sekizawa A, Matsumoto K, Kukimoto I.
  • 雑誌名: Frontiers in microbiology 巻: 11 ページ: 596334
  • DOI: 10.3389/fmicb.2020.596334.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Human Papillomavirus (HPV) Genotyping Assay Suitable for Monitoring the Impact of the 9-Valent HPV Vaccine (2020)
  • 著者名/発表者名: Kukimoto I, Matsumoto K, Takahashi F, Iwata T, Tanaka K, Yamaguchi-Naka M, Yamamoto K, Yahata H, Nakabayashi M, Kato H, Tsuda N, Onuki M, Yaegashi N; MINT Study II Group.
  • 雑誌名: Tohoku J Exp Med 巻: 251 ページ: 287-294
  • DOI: 10.1038/s41598-020-75133-2.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Use of Cap Analysis Gene Expression to detect human papillomavirus promoter activity patterns at different disease stages (2020)
  • 著者名/発表者名: Taguchi A, Nagasaka K, Plessy C, Nakamura H, Kawata Y, Kato S, Hashimoto K, Nagamatsu T, Oda K, Kukimoto I, Kawana K, Carninci P, Osuga Y, Fujii T.
  • 雑誌名: Sci Rep 巻: 10 ページ: 17991
  • DOI: 10.1038/s41598-020-75133-2.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Molecular epidemiology of human papillomavirus 18 infections in Japanese women (2020)
  • 著者名/発表者名: Yamaguchi-Naka M, Onuki M, Tenjimbayashi Y, Hirose Y, Tasaka N, Satoh T, Morisada T, Iwata T, Sekizawa A, Matsumoto K, Kukimoto I.
  • 雑誌名: Infect Genet Evol 巻: 83 ページ: 104345
  • DOI: 10.1016/j.meegid.2020.104345.
  • 査読あり
• [学会発表] 日本人女性でのHPV18ゲノム配列の分子疫学解析 (2020)
  • 著者名/発表者名: 柊元 巌, 岩田 卓, 小貫麻美子, 松本光司
  • 学会等名: 第79回日本癌学会学術総会