| 研究課題/領域番号 |
20K09875
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
田村 正人 北海道大学, 歯学研究院, 教授 (30236757)
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| 研究分担者 |
田村 潔美 北海道大学, 歯学研究院, 助教 (90399973)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | オステオアドへリン / 骨芽細胞 / 脂肪細胞 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は骨芽細胞が産生することが知られているスモールロイシンリッチプロテオグリカン (SLRP)の一つであるオステオアドへリン (Osad)について，新たな機能である他組織との関連性の解明を目的とした。すなわち，骨組織と脂肪組織の異種組織間の機能的なクロストークの詳細な分子機構を調べ，この分子が骨組織から脂肪組織へのシグナル分子として脂肪細胞分化や脂質代謝に及ぼす作用とその機構を明らかにする。本研究により，これまで明らかではなかった個体レベルにおける骨と脂質代謝との関連の解明を目指すものである。まず，本研究で用いるための組換えOsadのための発現プラスミドを作成した。このOsad発現プラスミドを293細胞にリポフェクションした。その後，培養上清を回収しいくつかの生化学的ステップにより濃縮・精製を行い，組換えOsad分画を得た。この組換えOsadを3T3-L1細胞に加えて培養し，Oil RedO染色により脂肪細胞分化を調べたところ，染色性が増加し脂肪細胞分化が促進された。同時にsclerostinを加えたところ，脂肪細胞分化はさらに促進された。この培養系でトータルRNAを採取し，白色脂肪細胞分化，脂肪酸の取り込み・輸送・酸化など脂質代謝に関わる分子のmRNA発現をリアルタイムPCRを用いて調べたところ，これらの発現量が増加した。Osadは脂肪細胞分化のみならず，脂肪酸合成やコレステロール代謝といった脂質代謝系に対しても影響を及ぼすことが明らかになった。また，この作用にはOsadのN末部分が重要な役割を果たしている可能性が考えられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
令和3年度の研究計画に基づき研究を実施し，以下の研究成果を得たため。
293細胞にOsad発現プラスミドをトランスフェクトし，組換えOsadを得た。この組換えOsadを3T3-L1細胞に加えて培養したところ，Oil RedO染色の増加が見られた。また，全RNAを採取しPPAR，C/EBP, LPL (1ipoprotein 1ipase)，FAT (fatty acid transporter)，UCP (uncoup1ing protein)などの発現についてリアルタイムPCRを用いて調べたところ，mRNA発現が増加した。これらの研究成果はOsadが脂肪組織の脂肪細胞分化のみならず，脂質代謝系に対しても影響を及ぼすことを示しており，その意義はきわめて大きい。また，このOsadを過剰産生させたMC3T3-E1細胞を作成したところsclerostin mRNA発現が増加した。Sclerostinは脂肪細胞分化を促進するという研究代表者らのこれまでの報告とあわせて考えると、Osadが脂肪細胞分化・脂質代謝の調節因子となる新たな可能性が考えられた。また，この脂肪細胞分化促進にはOsadのN末部分の重要性が示された。これらより，本研究はおおむね順調に進展していると考えられた。
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| 今後の研究の推進方策 |
Osadは小型プロテオグリカンであり，そのコアプロテインにはロイシンリッチリピートドメイン，硫酸化チロシンドメインなど複数のドメイン構造が明らかになっている。現在、このドメインの変異体発現プラスミドを作成しており、今後の方針としては，この変異体OsadとLRP, sclerostinの分子間相互作用を調べる。それぞれのmycタグを付加用のベクターに挿入し，コンストラクトを作成する。培養細胞から抽出した溶液を抗体で免疫沈降したのち，タグ抗体でウエスタンブロットを行う。ドメイン構造の種々の変異体とそれぞれの分子の相互作用部位を同定する。また、脂質代謝調節ドメインを同定する。見出されたドメインの合成ペプチドを作成し脂肪細胞分化に及ぼす影響について検討していく予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
Covid19により，参加した学会がオンライン開催になったため旅費の使用がなかったため，および試薬類が想定よりも安価で購入できたため。
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