| 研究課題/領域番号 |
20K09875
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
田村 正人 北海道大学, 歯学研究院, 特任教授 (30236757)
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| 研究分担者 |
田村 潔美 北海道大学, 歯学研究院, 助教 (90399973)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | オステオアドヘリン / 骨芽細胞 / 脂肪細胞 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、SLRPの一つであるオステオアドへリン (Osad)について、骨組織と脂肪組織の異種組織間の機能的なクロストークの詳細な分子機構を調べ、この分子が骨組織から脂肪組織へのシグナル分子として脂肪細胞分化や脂質代謝に及ぼす作用とその機構を明らかにする。まず、組換えOsadのための発現プラスミドを作成し293細胞にトランスフェクションした。培養上清を回収し、これを用いてOsadの効果を調べた。培養上清を3T3-L1細胞に加えて培養し、Oil RedO染色を行い脂肪細胞分化について調べた。培養上清の添加によりOil RedOで染色された細胞は増加し、脂肪細胞分化の促進が明らかになった。ここに同時にsclerostinを加えたところ、脂肪細胞分化はさらに促進された。この培養系でトータルRNAを採取し、脂肪細胞分化、脂肪酸の取り込み・輸送・酸化など脂質代謝に関わる分子の発現を調べたところ、PPARγ，C/EBP-α, LPL (1ipoprotein 1ipase)，FAT (fatty acid transporter)，UCP (uncoup1ing protein)などの発現の発現量が増加した。すなわちOsadは脂肪細胞分化のみならず，脂肪酸合成といった脂質代謝系に対しても影響を及ぼした。Osadは小型プロテオグリカンであり，そのコアプロテインにはロイシンリッチリピートドメイン，硫酸化チロシンドメインなど複数のドメイン構造が明らかになっている。そこで、Osadの種々のdeletion mutantを作成し、同様の検討を行った。Osadのコアプロテインのロイシンリッチリピートドメインを失わせると脂肪細胞分化の促進作用が失われた。本年度までに得られた結果から、SLRPのロイシンリッチリピートドメインが脂肪組織における脂質代謝に影響を及ぼすことが明らかになった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
令和4年度の研究計画に基づき研究を実施し，以下の研究成果を得たため。
293細胞にOsad発現プラスミドをトランスフェクトし，培養上清を得た。この培養上清を3T3-L1細胞に加えて培養したところ，Oil RedO染色の増加が見られた。また，全RNAを採取しPPARγ、C/EBP-α、LPL (1ipoprotein 1ipase)、FAT (fatty acid transporter)、UCP (uncoup1ing protein)などの発現についてリアルタイムPCRを用いて調べたところ、mRNA発現が増加した。これらの研究成果はOsadが脂肪組織の脂肪細胞分化のみならず，脂質代謝系に対しても影響を及ぼすことを示している。さらに、Osadの種々のdeletion mutantを作成し、同様の検討を行った。Osadのコアプロテインのロイシンリッチリピートドメインを失わせたところ、Oil RedO染色の増加が減少した。また、PPARγ、C/EBP-α、LPL およびUCPのmRNA発現の増加も減少し、脂肪細胞分化の促進作用が失われた。これらの結果から、Osadのコアプロテインのロイシンリッチリピートドメインが脂肪細胞分化により重要であるという新規の知見が得られ、Osadが脂肪細胞分化・脂質代謝の調節因子という新たな可能性が考えられた。これらより、本研究はおおむね順調に進展していると考えられた。
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| 今後の研究の推進方策 |
小型プロテオグリカンであるOsadのコアプロテインには、複数のドメイン構造が明らかになっている。今後の方針としては、このOsadとLRP、sclerostinなど他の分子との分子間相互作用を調べる。それぞれのcDNAを用いドメイン構造の種々の変異体発現ベクターを作成する。これらの発現ベクターを細胞にトランスフェクトする。その後、培養細胞から抽出した溶液を抗体で免疫沈降したのち，タグ抗体でウエスタンブロットを行う。これらの検討によりOsadと他分子の相互作用とそれに関わるドメインを同定する。これにより、Osadの脂質代謝調節ドメインが明らかになると考えられる。それらのドメインの合成ペプチドを作成し脂肪細胞分化に及ぼす影響についても検討を行う予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究で用いる試薬類に一部変更があり、想定よりも安価で購入できたため。次年度では、作成する変異体発現ベクターの種類を増やし、分子間相互作用に関与するドメインの検討をさらに詳細に行う計画である。
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