CCN２の転写因子様機能を介した線維症のキープレイヤー筋線維芽細胞分化機構の解明

2020 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 20K09889
• 研究機関: 岡山大学
• 研究代表者: 西田 崇 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 准教授 (30322233)
• 研究分担者: 滝川 正春 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 教授 (20112063) ; 久保田 聡 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 教授 (90221936) ; 服部 高子 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 助教 (00228488) ; 青山 絵理子 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 助教 (10432650) ; 高江洲 かずみ (河田かずみ) 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 助教 (10457228)
• 研究期間 (年度): 2020-04-01 – 2023-03-31
• キーワード: 線維化 / イントラクリン作用 / CCN2 / PU.1

研究実績の概要

線維性疾患は組織内にコラーゲンが過剰に沈着し、正常な組織機能が損なわれる慢性疾患である。近年、筋線維芽細胞が線維化のキープレイヤーとして注目されているが、その分化機構は未だ不明である。本研究課題の目的は線維化の進行に重要な役割を担うと考えられているCellular communication network factor 2 (CCN2)が筋線維芽細胞の分化にどのように関わっているのかをイントラクリン作用の観点から解明することである。当該年度では、未分化間葉系細胞株C3H10T1/2細胞を用いてCCN2にイントラクリン様の作用を誘導し、筋線維芽細胞への分化に対する影響を解析した。以下にその結果を示す。
1.シグナルペプチドを欠失したCCN2の発現プラスミド(SP-Ccn2)を構築し、C3H10T1/2細胞に遺伝子導入した。対照群としてシグナルペプチドを付加したCCN2の発現プラスミド(SP+Ccn2)を用いた。CCN2が核内に移行するかを蛍光免疫染色で調べた結果、SP+Ccn2を遺伝子導入した細胞ではCCN2が細胞質に局在したのに対し、SP-Ccn2を遺伝子導入した細胞ではCCN2は一部核内に見られた。
2.1.で作製した発現プラスミドをC3H10T1/2細胞に遺伝子導入し、筋線維芽細胞分化に重要な転写因子であるPU.1の遺伝子発現レベルを定量RT-PCR法で解析した。結果、SP+Ccn2を遺伝子導入した群ではempty vectorを導入した群と変わらなかったが、SP-Ccn2を遺伝子導入した群はPU.1の遺伝子発現レベルが有意に上昇した。
3.PU.1の標的分子であるテネイシンC及びPDGFの産生量をWestern blot解析で調べた結果、SP-Ccn2を導入した群で両分子の産生量の増加が見られた。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

令和2年度の研究実施計画はSP-Ccn2プラスミド及びSP+Ccn2プラスミドを構築し、CCN2が核内に移行するのか、そして筋線維芽細胞分化のキーとなる転写因子PU.1に対してイントラクリン作用を有しているのかを明らかにすることに主眼を置いた。そのため、SP-Ccn2プラスミドの遺伝子導入によって、PU.1の遺伝子発現レベルが有意に上昇したこと、及びその標的分子であるテネイシンCやPDGFの発現上昇をタンパク質レベルで確認したことから、本研究課題は計画通りに進展していると考える。しかし、一部、PU.1のプロモーターの単離が進展していない点とC3H10T1/2細胞を用いたCcn2ノックアウト細胞の構築準備に着手できなかった点を考慮すると、計画以上に進展しているとは言い難いため、令和2年度は概ね順調に進展していると判断した。

今後の研究の推進方策

令和3年度は、核内に移行したCCN2がPU.1のプロモーターに対してどのような作用を有しているのかを明らかにする。そのためには、昨年度、着手できなかったPU.1のプロモーターを単離する。そのプロモーターを用いてreporter プラスミドを構築し、reporter gene assayを行う。また、PU.1発現プラスミドも同時に構築する。Ccn2をゲノム編集技術でノックアウトしたC3H10T1/2細胞にPU.1発現プラスミドを遺伝子導入し、筋線維芽細胞への分化に対する影響を解析する。

次年度使用額が生じた理由

令和2年度はSP-Ccn2プラスミド及びSP+Ccn2プラスミドの構築とこれらプラスミドを用いた解析に主眼を置いたため、PU.1発現プラスミドの構築まで着手できなかった。また、C3H10T1/2細胞のCCN2をゲノム編集技術でノックアウトする実験も着手することができなかった。そのため、次年度使用額が生じた。
令和3年度はPU.1発現プラスミドの構築を行うと共にC3H10T1/2細胞を用いたCCN2ノックアウト細胞の構築を行う予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Bipartite regulation of cellular communication network factor 2 and fibroblast growth factor 1 genes by fibroblast growth factor 1 through histone deacetylase 1 and fork head box protein A1. (2021)
  • 著者名/発表者名: El-Seoudi, A., Nishida, T., Mizukawa, T., Hattori, T., Kawata, K., Taha, E. A., Takigawa, M., Kubota, S.
  • 雑誌名: J. Cell Commun. Signal. 巻: 15(1) ページ: 81-91
  • DOI: 10.1007/s12079-020-00600-4.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] RFX1-mediated CCN3 induction that may support chondrocyte survival under starved conditions. (2021)
  • 著者名/発表者名: Mizukawa, T., Nishida, T., Akashi, S., Kawata, K., Kikuchi, S., Kawaki, H., Takigawa, M., Kamioka, H., Kubota, S.
  • 雑誌名: J. Cell. Physiol. 巻: 236 ページ: 6884-6896
  • DOI: 10.1002/jcp.30348.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Suppression of adipocyte differentiation by low-intensity pulsed ultrasound via inhibition of insulin signaling and promotion of CCN family protein 2. (2020)
  • 著者名/発表者名: Nishida, T., Nagao, Y., Hashitani, S., Yamanaka, N., Takigawa, M., Kubota, S.
  • 雑誌名: J. Cell. Biochem. 巻: 10 ページ: -
  • DOI: 10.1002/jcb.29680.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Roles of interaction between CCN2 and Rab14 in aggrecan production by chondrocytes. (2020)
  • 著者名/発表者名: Hoshijima, M., Hattori, T., Aoyama, E., Nishida, T., Kubota, S., Takigawa, M.
  • 雑誌名: Int. J. Mol. Sci. 巻: 21 ページ: -
  • DOI: 10.3390/ijms21082769.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Regulation of cellular communication factor 2 (CCN2) in breast cancer cells via the cell-type dependent interplay between CCN2 and glycolysis. (2020)
  • 著者名/発表者名: Akashi, S., Nishida, T., Mizukawa, T., Kawata, K., Takigawa, M., Iida, S., Kubota, S.
  • 雑誌名: J. Oral Biosci. 巻: 20 ページ: -
  • DOI: 10.1016/j.job.2020.07.001.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Retrotransposons manipulating mammalian skeletal development in chondrocytes. (2020)
  • 著者名/発表者名: Kubota, S., Ishikawa, T., Kawata, K., Hattori, T., Nishida, T.
  • 雑誌名: Int J Mol Sci. 巻: 21 ページ: -
  • DOI: 10.3390/ijms21051564.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Roles of CCN2 as a mechano-sensing regulator of chondrocyte differentiation. (2020)
  • 著者名/発表者名: Nishida, T., Kubota, S.
  • 雑誌名: Jpn. Dent. Sci. Rev. 巻: 56 ページ: 119-126
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] 軟骨細胞における解糖系によるCCN3遺伝子発現制御メカニズム。 (2021)
  • 著者名/発表者名: 水川朋美、西田 崇、明石 翔、上岡 寛、滝川正春、久保田聡
  • 学会等名: 第33回日本軟骨代謝学会
• [学会発表] Regulation of CCN3 gene expression by glycolytic activity in chondrocytes. (2020)
  • 著者名/発表者名: Mizukawa, T., Nishida, T., Akashi, S., Kamioka, H., Takigawa, M., Kubota, S.
  • 学会等名: The 9th International Orthodontic Congress
  • 国際学会
• [学会発表] 軟骨細胞での解糖活性によるCCN3遺伝子の発現調節。 (2020)
  • 著者名/発表者名: 水川朋美、西田 崇、明石 翔、掘 綾花、高柴正悟、上岡 寛、滝川正春、久保田聡
  • 学会等名: 第61回日本生化学会 中国・四国支部例会
• [学会発表] Effect of melatonin on rhythmic gene expression in human articular chondrocytes. (2020)
  • 著者名/発表者名: Fu, S., Kuwahara, M., Uchida, Y., Hyashi, D., Shimomura, Y., Takagaki, A., Nishida, T., Nakata, E., Furumatsu, T., Kondo, S., Maruyama, Y., Hattori, A., Kubota, S., Hattori, T.
  • 学会等名: 第93回日本生化学会大会
• [学会発表] CCN2の核移行による線維化の制御。 (2020)
  • 著者名/発表者名: 西田 崇、滝川正春、久保田聡
  • 学会等名: 第62回歯科基礎医学会
• [学会発表] フッ素イオンによるCCNファミリー遺伝子の制御を介した歯肉線維化抑制効果の検証。 (2020)
  • 著者名/発表者名: 水川朋美、西田 崇、上岡 寛、久保田聡
  • 学会等名: 第79回日本矯正歯科学会
• [学会発表] LIPUSによる脂肪細胞分化の抑制と骨芽細胞分化への影響。 (2020)
  • 著者名/発表者名: 西田 崇、滝川正春、久保田聡
  • 学会等名: 第38回日本骨代謝学会学術集会
• [学会発表] non-coding RNAを介したメトホルミンの抗線維化作用の解析。 (2020)
  • 著者名/発表者名: 近藤 星、服部高子、桑原実穂、Fu Shanqi、西田 崇、吉岡洋祐、森谷徳文、飯田征二、滝川正春、久保田聡
  • 学会等名: 第43回日本分子生物学会年会
• [備考] 口腔生化学分野ホームページ
  • URL: http://www.okayama-u.ac.jp/user/seika/