2021 年度実施状況報告書

歯周病細菌の９型分泌機構（T9SS）の発現調節におけるフィードバック制御の解明

研究課題

研究課題/領域番号	20K09921
研究機関	長崎大学
研究代表者	中山浩次長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 客員研究員 (80150473)
研究分担者	雪竹英治長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 技術職員 (30380984) 庄子幹郎長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 准教授 (10336175) 内藤真理子長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 教授 (20244072)
研究期間 (年度)	2020-04-01 – 2023-03-31
キーワード	細菌 / 歯学 / 生体分子 / 感染症
研究実績の概要	病原細菌の多くは毒素、プロテアーゼなどの酵素、凝集素などを菌体表面および菌体外に分泌する。グラム陰性菌の場合、現在、9種類（1型～9型）の分泌機構が報告されている。私たちは9型分泌機構（T9SS）を世界にさきがけて口腔嫌気性細菌ポルフィロモナス・ジンジバリスで発見した。この分泌機構はバクテロイデーテス門に含まれる多くの細菌が有していることがその後の研究でわかってきた。ポルフィロモナス・ジンジバリスは慢性歯周炎の最重要病原細菌であり、本菌の重要な病原因子である強力なプロテアーゼ、ジンジパインはT9SSで分泌される。T9SSは二成分制御系PorXYとECFシグマ因子SigPのシグナル経路により発現調節されるが、調節系の全体像は不明であった。本研究は、PorXY-SigPシグナル経路の上流に位置する新規の外膜タンパク質PorAによるフィードバック制御を解明することにあり、その成果は歯周病細菌を始めとするバクテロイデーテス門細菌のT9SSをコントロールする方法の開発という応用研究に発展する可能性がある。 T9SSで分泌されるタンパク質にはC末端側にコンセンサスモチーフがあり、T9SS CTDという。PorAはT9SS CTDをもつタンパク質のなかで2番目に分子量が小さい外膜タンパク質であり、PorA欠損変異株ではSigPシグマ因子の発現がほとんど検出されないことがわかった。この結果はPorX欠損変異株でSigPが検出されないことと類似しており、PorAがPorXY-SigPシグナル経路に関連する調節タンパク質である可能性が出てきた。PorAは外膜タンパク質であり、T9SS CTDをもつタンパク質PorAの役割を明らかにすることは「T9SSがどのように発現調節されているか」の解明につながる可能性がある。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由 (1)PorAとPorYとの関係：内部領域にHisタグを導入したPorA（PorA::His145）遺伝子を作製した。PorA::His145はPorA欠損株のT9SS欠失性を完全に回復させることがわかった。PorA::His145遺伝子をΔporA ΔporK株に導入した株からニッケルカラムにてPorA::His145タンパク質を精製し、そのタンパク質画分にPorYがあるかどうかを抗PorY抗体を用いたイムノブロットにて検討したところ、PorYの分子量に相当する位置に抗PorY抗体に反応するバンドを得た。さらにこの結果を確認するため、このタンパク質画分に含まれるタンパク質について定量的プロテオミクスにて解析したところ、PorA, PorY, PorW, PorV, PorD, Sovが検出された。PorAとPorYとの結合を強く示唆するとともにPorAとPorW, PorV, PorD, Sovとの結合が示唆された。 (2)プロ型PorAはシグナリング分子か：PorUプロテアーゼの認識領域を欠損したPorAを構築し、このPorU非認識PorA株でT9SSが正常に機能するかどうかを調べた。PorA-His145-Δ(T162 D163)はPorA欠損株のT9SS欠失性を完全に回復させたが、この株ではA-LPS結合型PorAは形成されないことがわかった。すなわち、プロ型PorAがシグナリング分子であることが示唆された。 (3)PorAの構造解析にて判明したリガンドとの想定結合部位の周辺の構造を変化させる変異を導入したPorA遺伝子を複数作製し、PorA欠損株のT9SS欠失性を回復しない変異遺伝子を探索したが、いまのところ、発見していない。PorAの機能にリガンドは必要ないかもしれない。以上より更なる解析が必要であるが、全体的には予定通りに進んでいることからおおむね順調と判断した。
今後の研究の推進方策	令和3年度の研究からCTD領域を有するプロ型PorAがPorYと直接結合するシグナル分子である可能性が示唆された。PorYは内膜タンパク質であるのでこの結合はペリプラズムで生じていることが予想される。そこで令和4年度は以下の実験を行う。 (1)細菌のTEM 1 beta lactamaseシステムを用いたtwo-hybrid法にてPorAとPorYのどの領域が結合に関与しているかを詳細に検討する。もし、PorAのCTD領域とPorYとが相互作用するのであれば、A-LPS結合型PorA（CTD領域を欠失している）はPorYへのシグナリングに関与しない分子であることが示唆される。 (2)PorAのCTD領域を残す形でN末端側を段階的に欠損した変異PorAを作製し、PorA欠損株に導入して相補するかどうかを検討する。 (3)porA遺伝子にランダムに変異を導入してPorAの機能に必須なアミノ酸残基やアミノ酸領域を同定する。 (4)PorAに結合する化合物を化合物ライブラリーから抽出し、P. gingivalis株のT9SSを阻害する化合物を探索する。
次年度使用額が生じた理由	物品の購入が予定よりも安価で済んだため、552円ほど次年度使用額が生じたが、この金額は消耗品費として次年度に使用する予定である。