接合上皮発現タンパク質の発現制御による歯周病治療戦略

2020 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 20K09945
• 研究機関: 日本大学
• 研究代表者: 小方 頼昌 日本大学, 松戸歯学部, 教授 (90204065)
• 研究分担者: 中山 洋平 日本大学, 松戸歯学部, 准教授 (30434088) ; 高井 英樹 日本大学, 松戸歯学部, 准教授 (30453898)
• 研究期間 (年度): 2020-04-01 – 2023-03-31
• キーワード: アメロチン / 歯肉上皮細胞 / TNF-α / 歯周炎 / マイクロRNA / miR-200b / IKKβ

研究実績の概要

アメロチン（AMTN）は，成熟期エナメル芽細胞と歯肉接合上皮に発現するエナメルタンパク質である。TNF-αは，歯肉上皮細胞（Ca9-22細胞）でのAMTNの遺伝子発現を増加させるが，
増加したAMTNの遺伝子発現へのmiR-200bの関与を解析した。Ca9-22細胞をTNF-αで刺激すると，miR-200bの発現が増加し，miR-200b発現プラスミドをCa9-22に導入すると，細胞でのmiR-200b の発現量が増加したが，コントロール発現プラスミドを導入してもmiR-200b の発現量に変化はなかった。TNF-α刺激により増加したAMTNmRNA量は，miR-200bの過剰発現で抑制され、miR-200bのインヒビターオリゴヌクレオチドを細胞に導入すると、AMTNmRNA量はさらに増加した。TNF-α刺激によるAMTNmRNA量の増加は，IKKβインヒビターのIMD0354とNF-κBインヒビターであるTriptplideで部分的に抑制された。Ca9-22細胞をTNF-αで経時的に刺激後，タンパク質を抽出し，Western blotを行った結果，AMTNタンパク質量は刺激3時間後から増加し，12時間後には最大に達した。また，TNF-α刺激６および12時間後にIKKβのタンパク質量の増加が認められた。IKKβの3-UTRにmiR-200bの結合配列があることから，Ca9-22細胞でのIKKβの遺伝子発現に対するmiR-200bの影響をTNF-α刺激有または無しで解析した。Ca9-22細胞でのIKKβmRNA量は，miR-200b過剰発現で抑制された。さらに，TNF-α刺激でIKKβmRNA量は増加し，miR-200b過剰発現で抑制された。以上の結果から，歯肉上皮細胞においてmiR-200bはAMTNとIKKβをターゲットにしてAMTN遺伝子発現を抑制することが判明した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

歯肉接合上皮で発現するアメロチン（AMTN）にターゲットを絞り、炎症サイトカインであるTNF-αのAMTNの遺伝子発現に対する影響を解析するとともに、AMTNの遺伝子発現へのマイクロRNAの1種であるmiR-200bの関与をCa9-22細胞を用いて解析した結果、TNF-α刺激により増加したAMTNmRNA量は，miR-200bの過剰発現で抑制されることが明らかになった。また、TNF-α刺激によるAMTNmRNA量の増加は，IKKβインヒビターで部分的に抑制されることが判明した。
Ca9-22細胞をTNF-αで経時的に刺激後，タンパク質を抽出し，Western blotを行った結果，AMTNタンパク質量は刺激3時間後から増加し，12時間後には最大に達し，TNF-α刺激６および12時間後にIKKβのタンパク質量の増加が認められた。
Ca9-22細胞でのIKKβmRNA 量は，miR-200b過剰発現で抑制されるが，TNF-α刺激でIKKβ　mRNA量は増加し，miR-200b過剰発現で抑制された。以上の結果が得られたことから，歯肉上皮細胞においてmiR-200bはAMTNとIKKβをターゲットにしてAMTN遺伝子発現を抑制することが判明し、研究は順調に進んでいる。

今後の研究の推進方策

アメロチン以外で接合上皮で発現するタンパク質である，Odontogenic ameloblast-associated protein（ODAM）の発現は成熟期エナメル芽細胞および接合上皮に限局する。接合上皮でのODAMの役割と炎症歯肉における転写調節機構を解明するために，歯肉上皮細胞でのODAMの遺伝子発現に対する炎症性サイトカインの影響について解析を行っていく。Ca9-22ヒト歯肉上皮細胞を、TNF-α（10 ng/ml）またはIL-1β（1 ng/ml）で経時的に刺激後，全RNAを抽出し，ODAMmRNA量およびタンパク質発現の変化をReal-time PCRおよびWestern blotで解析する。Ca9-22細胞をTNF-αまたはIL-1βで6時間刺激し，細胞内でのODAMタンパク質発現の変化を免疫染色で解析する。Ca9-22細胞をTNF-α（10 ng/ml）およびIL-1β（1 ng/ml）で3，6，12，24時間刺激し，ODAMのmRNA量およびタンパク質量の変化を解析予定である。Ca9-22細胞をTNF-α（10 ng/ml）およびIL-1β（1 ng/ml）で刺激後，免疫染色を行う予定である。

研究成果

• [国際共同研究] Mayo Clinic. Rochester(米国)
  • 国名: 米国
  • 外国機関名: Mayo Clinic. Rochester
• [国際共同研究] University of Toronto(カナダ)
  • 国名: カナダ
  • 外国機関名: University of Toronto
• [雑誌論文] Anti-heat shock protein 70 levels in gingival crevicular fluid of Japanese patients with chronic periodontitis. (2020)
  • 著者名/発表者名: Takai H, Furuse N, Ogata Y
  • 雑誌名: Journal of Oral Science 巻: 62 ページ: 281-284
  • DOI: 10.2334/josnusd.19-0159
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] MiR-200b suppresses TNF-α-induced AMTN production in human gingival epithelial cells. (2020)
  • 著者名/発表者名: Yamazaki-Takai M, Takai H, Iwai Y, Noda K, Mezawa M, Tsuruya Y, Yamaguchi A, Nakayama Y, Ogata Y
  • 雑誌名: Odontology 巻: 109 ページ: 403-410
  • DOI: 10.1007/s10266-020-00555-3
  • 査読あり
• [雑誌論文] Effects of Initial Periodontal Therapy on Heat Shock Protein 70 Levels in Gingival Crevicular Fluid from Periodontitis Patients. (2020)
  • 著者名/発表者名: Furuse N, Takai H, Ogata Y
  • 雑誌名: Journal of Clinical Medicine 巻: 9 ページ: 3072
  • DOI: 10.3390/jcm9103072
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Exposure to Porphyromonas gingivalis Induces Production of Proinflammatory Cytokine via TLR2 from Human Respiratory Epithelial Cells. (2020)
  • 著者名/発表者名: Watanabe N, Yokoe S, Ogata Y, Sato S, Imai K
  • 雑誌名: Journal of Clinical Medicine 巻: 9 ページ: E3433
  • DOI: 10.3390/jcm9113433
• [雑誌論文] Applying the Item Response Theory Graded Response Model. (2020)
  • 著者名/発表者名: Nomura Y, Morozumi T, Fukuda M, Hanada N, Kakuta E, Kobayashi H, Minabe M, Nakamura T, Nakayama Y, Nishimura F, Noguchi K, Numabe Y, Ogata Y, Saito A, Sato S, Sekino S, Sugano N, Sugaya T, Suzuki F, Takahashi K, Takai H, Takashiba S, Umeda M, Yoshie H, Yoshimura A, Yoshinari N, Nakagawa T
  • 雑誌名: Journal of Clinical Medicine 巻: 9 ページ: 3754
  • DOI: 10.3390/jcm9113754
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] A multicenter prospective cohort study on the effect of smoking cessation on periodontal therapies in Japan. (2020)
  • 著者名/発表者名: Nakayama Y, Mizutani K, Tsumanuma Y, Yoshino H, Aoyama N, Inagaki K, Morita M, Izumi Y, Murakami S, Yoshimura H, Matsuura T, Murakami T, Yamamoto M, Yoshinari N, Mezawa M, Ogata Y, Yoshimura A, Kono K, Maruyama K, Sato S, Sakagami R, Ito H, Numabe Y, Nikaido M, Hanioka T, Seto K, Fukuda J, Warnakulasuriya S, Nagao T
  • 雑誌名: Journal of Oral Science 巻: 63 ページ: 114-118
  • DOI: 10.2334/josnusd.20-0288
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] GRADEアプローチを用いた診療ガイドライン策定の試み ① インプラント周囲炎に対する外科的処置時に経口抗菌療法は有効ですか？ (2020)
  • 著者名/発表者名: 高井英樹、目澤優、中山洋平、小方頼昌、高橋慶壮
  • 学会等名: 第63回春季日本歯周病学会
• [学会発表] ニフェジピンによる薬物性歯肉増殖症歯肉における接合上皮特異的遺伝子の発現 (2020)
  • 著者名/発表者名: 中山洋平，井上英子，加藤彩子，岩井泰伸，高井瑞穂，鶴屋祐人，山口亜利彩，能田佳祐，小方頼昌
  • 学会等名: 第63回春季日本歯周病学会
• [学会発表] 歯周炎が唾液中のエクソソーム内の成分に及ぼす影響 (2020)
  • 著者名/発表者名: 3.山口 亜利彩，鶴屋 祐人，高井 瑞穂，目澤 優，高井 英樹，中山 洋平，小方 賴昌
  • 学会等名: 第63回春季日本歯周病学会
• [学会発表] IL-1βとTNF-αは歯肉上皮細胞におけるODAM遺伝子の転写を調節する (2020)
  • 著者名/発表者名: 鶴屋祐人，山口亜利彩，高井瑞穂，目澤優，高井英樹，中山洋平，小方賴昌
  • 学会等名: 第63回秋季日本歯周病学会
• [図書] Risk Factors for Peri-implant Diseases (2020)
  • 著者名/発表者名: Ogata Y Editor
  • 総ページ数: 120
  • 出版者: Springer
  • ISBN: 978-3-030-39184-3