| 研究課題/領域番号 |
20K09999
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| 研究機関 | 日本大学 |
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研究代表者 |
高橋 富久 日本大学, 歯学部, 教授 (40246905)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 骨細胞 / 骨芽細胞 / lamin A / 骨代謝 |
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| 研究実績の概要 |
核膜を構築する核ラミナ構成成分のlamin Aの骨細胞における発現メカニズムを明らかにするため，骨細胞様株化細胞MLO-Y4にlamin A cDNAを遺伝子導入し，lamin Aを過剰発現させた細胞株を樹立した。21個のクローンを樹立し，そのうちlamin Aの発現が強いクローンをY4-laminA (+)とし，ベクターのみ発現させた細胞株Y4-Vtと表現形質の変化を調べた。その結果，Y4-lamin A(+)とY4-Wtの細胞形態と増殖速度については有意な変化は認められなかった。また，alkaline phosphatase (ALP)とoste0calcin (OC) の発現を軽度に促進したが，有意差がみられるものではなかった。同じ骨タンパクであるBSA，Runx2，Osterixや，骨細胞マーカーとして考えられているCX43，E11/gp38 , DMP1，PHEX，MEPE，FGF23，SOST，MMP-2，-13，-14 の発現についても有意な変化は認められなかった。破骨細胞分化に関係するOPGとRANKLの発現についても有意な変化は認められなかった。次にMLO-Y4へlamin A cDNAのshRNAを遺伝子導入し，lamin Aの発現量をノックダウンさせた細胞株を樹立した。25個のクローンを樹立し，そのうち安定的のlamin Aの発現が抑制（70～80%減少）されているクローンをY4-lamin A(-)として同じくベクターのみを発現させたY4-Shと細胞形態，増殖速度はY4-Shと大きな違いはなかったが，培養7日目まで，ALP，Col1およびOCの発現の軽度な減少が認められた。他の骨タンパクと骨細胞マーカーおよび破骨細胞分化関連因子の発現は少なくとも当該年度に調べた細胞株では確認できなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
今年度はMLO-Y4へlamin Aの遺伝子発現を行い数種類のY4-lamin A(+)とY4-lamin A(-)を樹立したが，もともとMLO-Y4の細胞増殖はそんなに早くない為，細胞株の樹立に多くの時間を費やしてしまった。薬剤選択によっていくつかの細胞株が樹立されたが，すべての株についてlamin Aの発現を調べた訳でなく，比較的lamin Aの発現が強い細胞株あるいは顕著に抑制された細胞株をY4-lamin A(+)とY4-lamin A(-)としてそれぞれ実験に使用した。いくつかの細胞株について，少なくとも骨タンパクと骨細胞マーカーの発現を調べているがどれも、実績の概要で示した結果となった。しかし，未だに使用されていない細胞株についてもユニークな表現形質の変化が見られる可能性があるので，現在，残りのすべて細胞株についてリアルタイムRT-PCRによって骨芽細胞マーカーと骨細胞マーカーの発現変化を検討している。全ての細胞株で骨芽細胞マーカーと骨細胞マーカー，および破骨細胞分化関連因子の発現を調べた後，MAPKやWntシグナル系に関係する分子の発現レベルを検討する予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
Y4-lamin A (+)とY4-lamin A (-)における細胞内シグナル因子MAPKの発現とリン酸化パターンについて検討する。また， ERKとJNKとそれに追随して核内で活性化されるERK1/2，bcl-2，JunD，Elk4の発現とリン酸化についてWestern blotと蛍光抗体法によって検討する。さらに，lamin Aは老化関連転写因子NRF2の不活化と密接に関係していることから， NRF2の発現パターンと核内移行について蛍光抗体法によって観察する。
Y4-lamin A (+)とY4-lamin A (-)におけるWntとβ-cateninの発現，およびβ-cateninと相互作用するGSK-3β，Axinの発現パターンを遺伝子・タンパクレベル調べる。また，β-cateninの結合配列が組込まれた当研究室所有のTOP/EGFベクターをY4-lamin A (+)とY4-lamin A (-)へトランスフェクションし，GSK-3βの発現とAxinとの結合から解離した活性化β-cateninのDNA結合能と比較検討する。
Y4-lamin A (+)およびY4-lamin A (-)と非導入細胞(対照群)の遺伝子発現の違いを網羅的に検討するために，マイクロアレイを利用した解析によって検討する。各対象群の遺伝子発現パターンに比較して有意に発現の変動が認められたものについて再度，遺伝子・タンパクレベルで発現量の変化を詳しく調べ，lamin Aの発現をコントロールしている因子，あるいはlamin Aの下流で機能していると考えられる核内タンパクを同定する。
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