| 研究課題/領域番号 |
20K10117
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
神田 拓 広島大学, 医系科学研究科(歯), 専門研究員 (00423369)
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| 研究分担者 |
山崎 佐知子 広島大学, 病院(歯), 病院助教 (00632001)
大林 史誠 広島大学, 病院(歯), 歯科診療医 (20806096)
濱田 充子 広島大学, 病院(歯), 助教 (30760318)
岡本 哲治 東亜大学, その他の研究科, 教授 (00169153)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | Cowden症候群 / iPS細胞 / がん抑制遺伝子 |
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| 研究実績の概要 |
全身諸臓器の多発性過誤腫と高率に悪性腫瘍を合併する疾患であるCowden(カウデン)症候群の原因遺伝子はがん抑制遺伝子PTEN(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10)であると報告されている。本研究では本学倫理規定(第ヒ-72号研究課題名:口腔顎顔面領域に病変を有する遺伝子疾患患 者の遺伝子変異およびその遺伝子診断に関する研究)に基づき同意を得られたCowden症候群患者末梢血リンパ球(CS-PBMC)を採取し、PTEN遺伝子の新規変異を検索した。その結果PTEN遺伝子のヘテロ変異を認め,Codon 341 PhenylalanineのLeucineへ置換,codon 343 Valineのstop codonへの置換を確認した。同定された変異は現在まで報告されていない。また同変異によりPTEN蛋白はcodon342以降のC-末端側が欠損していると考えられた。次に無血清培地hESF9にてヒトES細胞の継 代培養，ヒトiPS細胞における未分化性と多分化能を維持可能な無血清培養系にて、センダイウイルスベクターによるCowden疾患特異性iPS細胞誘導を樹立した。次世代シーケンサーにより，PTENのエクソン8における新規生殖細胞変異（c.1020delTおよびc.1026G > A）を検出した．サンガーシークエンスにより、変異型アレルからのPTEN転写物は確認されなかった。健康なPBMCおよびiPSCと比較して、CS由来PBMCおよびCS-iPSCはいずれもPTEN転写産物の発現が有意に低下していた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究計画に基づき無血清培養系におけるCowden症候群疾患特異的iPS細胞(CS-iPS)を樹立した。今回われわれが確認した Cowden症候群患者のPTEN遺伝子変異はC2ドメインに存在し、codon342以降のC-末端側が欠損しており，渉猟し得たかぎり新規の変異部位と考えられた。CS-iPSCの誘導効率は0.24%を示し, 健常人由来iPSCのそれ(0.05%) と比較して有意に高値を示した。CS-iPSCは未分化マーカーを発現し、in vitroでの胚様体形成及び in vivoでのテラトーマ形成にて３胚葉への分化多能性を有していることを確認した。CS-iPSCにおけるPten mRNA及びPTEN蛋白の発現量は、健常人由来iPSCのそれらと比較して約1/2に低下し、pAKTの発現上昇が認められた。CS-iPSCでは、Pten遺伝子のexon 8の同一アレル内にc.1020delT及びc.1027G>Aを認め、これら変異に起因するsplicing 異常によりPTEN蛋白のハプロ不全が生じることで本症候群が発症していると考えられた。これらの概要をまとめ論文投稿を行なった。
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| 今後の研究の推進方策 |
Cowden症候群疾患特異的iPS細胞(CS-iPS)を用いて、In vivo系では分化多能性および自己複製能を検討し、In vitro系において樹立したiPS細胞の３次元培養を行い、腫瘍オルガノイドを作成する。ゲノムへのintegrationのないセンダイウイルス(SeVdp)を用いたがん抑制遺伝子PTEN変異Cowden患者由来iPS細胞を樹立し，フィーダーフリー・無血清培地条件での発症メカニズムの解明や機能解析を応用し，安全な再生医療の臨床応用を目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
異動及びコロナ感染状況拡大のため研究施設への移動等に制限があったので次年度使用額が生じた。現在は研究協力者と連携し継続的に行っている。また新たにリキッドバイオプシーの検索を専門とする研究協力者を追加した。これにより本疾患の遺伝子異常の早期発見や遺伝子異常の見つかった患者の治療薬の選択などを「リキッドバイオプシー パネル解析」や「リキッドバイオプシー デジタルPCR」などの技術の応用にて検索をすすめる。
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