2020 年度実施状況報告書

苦味受容体TAS2Rファミリーによる小児の齲蝕予防メカニズムの解明

研究課題

研究課題/領域番号	20K10203
研究機関	広島大学
研究代表者	香西克之広島大学, 医系科学研究科(歯), 教授 (10178212)
研究分担者	岩本優子広島大学, 医系科学研究科(歯), 助教 (00748923) 光畑智恵子広島大学, 医系科学研究科(歯), 准教授 (10335664)
研究期間 (年度)	2020-04-01 – 2023-03-31
キーワード	齲蝕予防 / 苦味受容体 / TAS2Rファミリー / 小児齲蝕 / 齲蝕原因菌
研究実績の概要	齲蝕発症には多因子が関わっている。そのため齲蝕予防に対しては広く知られているKeyesの提唱した齲蝕の病因論に基づいた対策が行われ、疫学的に齲蝕発症低下には貢献していながらも未だ低年齢重度齲蝕発症児の加療を行うことが多々あるのが現状である。苦味受容体は口腔内で味覚をつかさどる受容体の１つだが、口腔以外の器官にも存在し、免疫に関与していることが報告されている。齲蝕発症の新規抑制因子として苦味受容体をターゲットととし、味覚発達期にある小児を対象として苦味受容体の分布量や変異と齲蝕発症動態について明らかにし、齲蝕抑制への関与とそのメカニズムについて明らかにすることを目的としている。苦味受容体は苦味物質の認識を行うと同時に、齲蝕原因菌などの口腔内の感染に対する防御機構が機能することが期待される。本研究では低年齢の重度齲蝕児を対象とし、苦味受容体のTAS2R発現とその変異が齲蝕抑制にどのように関係するかについてその分子メカニズムを解明したいと考えている。まず、低年齢重症齲蝕児の苦味受容体の変異解析を行うために当診療室を受診した低年齢（5歳未満）の重症齲蝕児と主養育者ならびに同年齢で齲蝕のない患児とその主養育者の口腔より粘膜細胞を採取し、ゲノムDNAを準備したのち、次世代シークエンサーを用いて25種類のTAS2Rについてシークエンス解析を行う。一方、マウスを用いて水と砂糖水とで飼育を行い、両群における舌上の苦味受容体の発現量について解析を行う実験の準備を行っている。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 4: 遅れている理由低年齢の重度齲蝕児を対象とし、苦味受容体のTAS2R発現とその変異が齲蝕抑制にどのように関係するかについてその分子メカニズムを解明するために、人を用いた研究として低年齢重症齲蝕児の苦味受容体の変異解析を行うために当診療室を受診した低年齢（5歳未満）の重症齲蝕児と主養育者ならびに同年齢で齲蝕のない患児とその主養育者の口腔より粘膜細胞を採取し、ゲノムDNAを調整したのち、次世代シークエンサーを用いて25種類のTAS2Rについてシークエンス解析を行うための準備を行ってきたが、2020年4月に新型コロナウイルス感染拡大阻止のため出された緊急事態宣言に伴い、診療に対する制限がかかり、一時期は急患対応のみとなった。その後感染対策を行った後に診療を行うことは可能になったが、小児の新型コロナウイルス感染に関しては症状なくウイルスを保持している可能性が高く、口腔内からのサンプル採取にともない新型コロナウイルスも収集する可能性があることから感染の終息あるいはサンプル採取が可能の状態になる時期を待って進めていくこととしたため全く研究を進めることができていない。動物実験に関しても新規の研究の遂行について延期することが推奨され、その後も、新型コロナウイスル感染拡大防止のために出された大学内のさまざまな制約の中で診療・教育等を行うことで十分な研究時間の捻出が難しく、まだ最近研究スタートのための準備を始めたため、この系の研究も進んでいない状況となっている。
今後の研究の推進方策	2021年度は研究2年目となるが、新型コロナウイルス感染症については世界的にも変異株が出ており、我々の生活圏内でも変異株が検出されているため、現時点でもまだ患児や主養育者の口腔内からのサンプル回収は難しいと考えられ、感染の危険性を含んでいる間は延期とし、in vitroやマウスを用いて行える研究からスタートとすることにして準備を始めることにした。苦味受容体のうちTAS2R38については口腔外の器官で免疫に関与していることが報告されていることから、TAS2R38とその変異株をターゲット遺伝子としcDNAを構築したのち、発現ベクターを作製し、哺乳類細胞で発現させることで、Cycloheximideに対する細胞応答として、細胞内のカルシウムの動向や一酸化窒素の放出とについて比較検討する。その後、齲蝕原因菌Mutans streptococciとの共存での免疫反応について検討を行う。加えて、すでに齲蝕との関連性を疑われていると報告されているTASR2についても同様に齲蝕原因菌での変化について検討を行う。一方、マウスを用いて水と砂糖水とで飼育を行い、両群における舌上の苦味受容体の発現量について解析を行う実験については妊娠マウスの購入準備をしており、まず予備実験を行なった後に、苦味受容体の発現量についての解析を行っていく予定としている。
次年度使用額が生じた理由	2020年4月に新型コロナウイルス感染拡大阻止のため出された緊急事態宣言に伴い診療制限がかかり、小児患者からの口腔内からのサンプル採取ができなくなった。従って口腔粘膜からのゲノムDNA調整，次世代シークエンサーによるシークエンス解析ができなくなり，そのための試薬などの経費の使用がなくなった。さらにそれに続くマウス実験も遅れたため，これらの実験材料や動物に関する費用の多くを次年度に持ち越すこととなった。２年目に当たる2021年度は，新型コロナウイルス感染拡大の終息見込みが立たないため実験計画の見直しを行うこととした。すなわち人を用いた研究内容を延期し，in vitroやマウスを用いて行える研究をまず実施することとした。苦味受容体TAS2R38とその変異株をターゲット遺伝子としcDNAを構築したのち、発現ベクターを作製し、哺乳類細胞で発現させることで、Cycloheximideに対する細胞応答として、細胞内のカルシウムの動向や一酸化窒素の放出について比較検討する。その後、齲蝕原因菌との共存での免疫反応について検討を行う。加えて、TASR2についても同様に齲蝕原因菌での変化について検討を行い齲蝕との関連を確認する。動物実験については，マウスを用いて水と砂糖水とで飼育を行い、苦味受容体の発現量についての解析を行う計画とした。