| 研究課題/領域番号 |
20K10210
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| 研究機関 | 鹿児島大学 |
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研究代表者 |
窪田 直子 鹿児島大学, 医歯学域歯学系, 助教 (40569810)
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| 研究分担者 |
佐藤 正宏 鹿児島大学, 総合科学域総合研究学系, 教授 (30287099)
稲田 絵美 鹿児島大学, 医歯学域鹿児島大学病院, 講師 (30448568)
野口 洋文 琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (50378733)
齊藤 一誠 新潟大学, 医歯学系, 准教授 (90404540)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 遺伝子工学的手法 / アルカリホスファターゼ / ヒト乳歯歯髄細胞 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、先天的にアルカリホスファターゼ（ALP）活性が低下した低ホスファターゼ症（HPP）患者由来のHDDPC（以下、HPP-HDDPC）と健康小児由来のHDDPC（以下、N-HDDPC）の多分化能などの特性を比較検討することで、ALPの存在意義を確認し、さらに、HPP-HDDPCにALP発現ベクターを遺伝子導入し、HDDPCの本来の多分化能の回復を試みることで、「多分化能性維持におけるALPの役割を明らかにする」ことを目的とする。
実施計画では、HPP-HDDPCの不死化処理後、①HPP-HDDPCの多分化能性とiPS細胞形成能の検討による特性解明、②HPP-HDDPCへのALP発現ベクターの遺伝子導入によるALP陽性株の取得、③ALP陽性株の多分化能性とiPS細胞形成能の検討による特性解明、からHPP-HDDPCの機能回復を証明する予定である。
2020年度には、HPP患者から取得したHDDPCについて、特性解析の一部とALP発現ベクターの遺伝子導入実験を行った。HPP-HDDPCについてALP染色を実施したところ、ALP陽性細胞を認めなかった。また、山中４因子（Oct-3/4, Sox2, Klf4, L-Myc）を搭載したプラスミドをエレクトロポレーション法にて導入した。遺伝子導入後10日間は 20％牛胎仔血清を含む培地にて培養を行い、以降、マウス胎仔由来feeder上に細胞を播種。iPS細胞用培地にて培養を行ったが、iPS細胞樹立はできなかった。
他方、ALP cDNA発現ユニットにpiggyBac成分を導入させたトランスポゾンベクターpT-TNSALPをHPP-HDDPCに遺伝子導入後、ALP染色を実施した結果、ALP陽性細胞の出現を確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
2020年度はHPP-HDDPCを取得。まず、ALP発現の有無を市販のALP活性検出キットを用い確認した結果、ALPの発現を認めなかった。この細胞に山中４因子を搭載したプラスミドを導入。遺伝子導入後10日間は 20％牛胎仔血清を含む培地にて培養を行い、以降、マウス胎仔由来feeder上に細胞を播種。iPS細胞用培地にて培養を行ったが、iPS細胞樹立はできなかった。この結果は、仮説（ALP低活性細胞はiPS化しにくい）通りであった。
次に、HPP-HDDPCにALP発現ベクターの遺伝子導入を試みた。ALP cDNA内蔵ベクターをAddgeneより購入し、これに哺乳類細胞への遺伝子導入効率が非常に高いとされるトランスポゾンの一種piggyBac（PB）成分を導入し、トランスポゾンベクターpT-TNSALPを作成した。HPP-HDDPCにpT-TNSALP + pT-neo［neomycin耐性遺伝子（neo）発現ベクター］+ pTrans（PB transposase発現ベクター）を遺伝子導入後、ALP染色を実施した結果、ALP陽性細胞の出現を確認した。
以上から、従来ALP活性の無いHPP-HDDDPCにALP発現ベクターを導入することで、ALP陽性細胞を作製できることが判った。
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| 今後の研究の推進方策 |
2021年度は引き続き、ALP陽性HPP-HDDPC株の取得を継続する。現状では、ALP発現ベクター導入により、ALP陽性細胞出現を確認したのみである。今後、G418を含む培地で細胞を選別し、stable transfectantを取得する。当該細胞は、ALPを恒常的に発現すると予想される。
ALP陽性HPP-HDDPC株については、細胞形態の観察、in vitroでの多分化能性の検討（分化誘導剤添加により神経や骨細胞などの分化細胞へ分化できるか）、iPS細胞形成能の有無（山中4因子導入によりiPS細胞が樹立できるかどうか）を検討する。ALP発現ベクターの遺伝子導入によりHPP-HDDPCが多分化能やiPS細胞形成能を獲得すれば、HDDPCにおいてALPは多分化能の維持に関与し、かつ、Wnt経路におけるsignal regulatorとしての役割を担っている可能性があると考えられる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
2021年度は細胞の遺伝子発現解析の機会が増える見込みである。また、成果について論文作成し、投稿する予定である。そのため、次年度使用額として翌年度分に助成金を持ち越した。よって、持ち越した研究費は細胞培養用試薬、分子生物学用酵素等の消耗品購入、論文校正、論文投稿費用として使用する予定である。
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